金 潔 張飛燕 謝麗分 劉 超 張慶宇 鄔繼文 呂龍寶，2*

(1.中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明，650000；2.中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心，昆明，650223)

滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)是中國特有的珍稀瀕危動物，也是世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄中的瀕危(EN)物種，其珍貴程度與大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)齊名。滇金絲猴是全世界除了人類之外，棲息地海拔最高的靈長類動物，僅分布于我國西南橫斷山脈，金沙江、瀾滄江和怒江之間滇西北和藏東南的狹小區(qū)域，海拔2 800—5 000 m之間的高山針葉林和狹長針闊混交林中，總數(shù)約3 000只。滇金絲猴不僅具有重大的觀賞和經(jīng)濟(jì)價值，還有很高的醫(yī)學(xué)研究價值。目前人工圈養(yǎng)滇金絲猴數(shù)量不到30只。在滇金絲猴的人工飼養(yǎng)和繁育中，動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與失衡常引起其腹瀉、消化吸收功能障礙、二重感染等疾病。胃腸道微生物的研究和利用是野生動物繁殖及種群保護(hù)的重要措施[1]。

腸道微生物直接參與宿主的食物消化、營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應(yīng)答等諸多生理活動[2]，維持腸道微生態(tài)平衡，提高食物消化利用率，減少腸道疾病發(fā)生，對滇金絲猴個體健康和人工繁育至關(guān)重要。目前，針對滇金絲猴腸道菌群的研究較少，其整個胃腸道菌群的信息仍處于未知狀態(tài)。本研究利用高通量測序，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)耗時長、不能完全反映樣本中微生物信息等缺陷，全面解析了滇金絲猴的腸道菌群結(jié)構(gòu)，旨在為滇金絲猴營養(yǎng)與健康的研究提供參考依據(jù)，對開展人工飼養(yǎng)、繁育和改良飼料配方均具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心，采集5只圈養(yǎng)成年(5—10歲)滇金絲猴的新鮮糞便于采糞管中，迅速放到液氮罐中帶回實驗室。在無菌條件下取糞便內(nèi)部分裝并分別編號R1—R5，其中R1—R4為健康滇金絲猴糞便，R5為亞健康滇金絲猴的半干糞便，置于-80℃冰箱中保存。采樣的健康滇金絲猴精神狀況和食欲良好，以人工飼料為食并輔有蒸糕、蘋果或紅薯，亞健康滇金絲猴精神狀況和食欲較健康猴差，僅以蒸糕為食，且體重遠(yuǎn)低于健康滇金絲猴。

1.2 細(xì)菌總DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用MOBIO公司PowerFecalTMDNA試劑盒，按照說明書上操作步驟抽提細(xì)菌基因組DNA。抽提完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測DNA質(zhì)量。以滇金絲猴腸道內(nèi)容物總DNA為模板，針對16S rRNA V3-V4區(qū)合成特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，使用的PCR儀為ABI GeneAmp 9700型。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物質(zhì)量合格后，根據(jù)其濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Axygen公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。

1.4 文庫構(gòu)建及測序

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段后進(jìn)行文庫模板的富集和氫氧化鈉變性，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit定量和檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

使用Cutadapt軟件reads進(jìn)行剪切，根據(jù)Barcode拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列得到原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)FLASH拼接、QIIME過濾、UCHIMEAlgorithm去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)，在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類和物種注釋。使用QIIME軟件計算每個樣品的Alpha多樣性指數(shù)；用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線；用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PICRUSt基因預(yù)測，并在各個分類水平上進(jìn)行物種組成及多樣性分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品序列與OTU聚類

經(jīng)Illumina HiSeq測序平臺得到原始數(shù)據(jù)后進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再進(jìn)行嵌合體過濾，5個樣品共得到60 598條可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。對所有樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為 OTUs。5個樣品共產(chǎn)生791條不同OTU，其中R5樣品中OTU(592條)最多，R3樣品中OTU(479條)最少，說明R5樣品中細(xì)菌物種最多，R3樣品中細(xì)菌物種最少。

2.2 細(xì)菌群落豐富度和多樣性分析

稀釋曲線是描述樣品多樣性的曲線，如圖1A所示，曲線在序列數(shù)為60 598條后趨向平坦，說明測序已包含絕大多數(shù)樣本信息。Rank abundance曲線可反映樣品中物種的豐富度和均勻度，如圖1B所示，物種豐富度的大小依次為 R5、R1、R4、R2、R3，與上述結(jié)論一致。綜上，此次測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有細(xì)菌。

Alpha多樣性用于分析樣品內(nèi)的微生物群落多樣性，表1列舉了5個樣品的菌群多樣性(Shannon)和菌群豐度指數(shù)(Chao1和 Ace)。由表1可知，R5的細(xì)菌菌群豐富度最高，其次是R1、R4、R2、R3；R1的細(xì)菌多樣性最豐富，其次是R4、R5、R2、R3。此外，覆蓋率指數(shù)越接近于1，表明測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種，本研究中各樣品如表1中所示覆蓋指數(shù)均大于0.99，說明樣本中序列沒有被測出的概率極低。

圖1 稀釋曲線和rank abundance曲線Fig.1 Rarefaction curve and rank abundance plot

表1 樣品中細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha diversity of bacteria in samples

2.3 滇金絲猴腸道細(xì)菌的組成分析

采用Mothur方法注釋得到12個門(phylum)19個綱(class)，31個目(order)47個科(family)，82個屬(genus)，65個種(species)。

2.3.1 門分類水平上的細(xì)菌組成

從門分類水平，按相對豐度前10作圖(圖2)。R1—R4 4組健康滇金絲猴腸道內(nèi)平均相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細(xì)菌有厚壁菌門(Firmicutes，78.41%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.97%)，R5亞健康滇金絲猴腸道內(nèi)相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細(xì)菌有厚壁菌門(78.93%)、擬桿菌門(8.13%)、螺旋體門(Spirochaetes，6.09%)、變形菌門(Proteobacteria，3.09%)。由此可見，厚壁菌門、擬桿菌門是健康滇金絲猴腸道菌群中的優(yōu)勢菌群。

2.3.2 屬分類水平上的細(xì)菌組成

由于從種水平起分類較多，因此選擇在屬水平作聚類分析，按相對豐度平均值排名前 10 的菌屬作聚類熱圖(圖3)。R1—R4 4組健康滇金絲猴腸道內(nèi)平均相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細(xì)菌有瘤胃球菌屬(Ruminococcus，6.29%)、未分類的毛螺菌科(unidentified Lachnospiraceae，4.20%)成員、普氏菌屬(Prevotella，3.24%)。R5亞健康滇金絲猴腸道內(nèi)相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細(xì)菌有梭菌屬(Clostridum，10.19%)、厭氧原體屬(Anaeroplasma，6.09%)、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio，7.06%)、 瘤胃球菌屬(4.70%)。

圖2 門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.2 Bacterial communities and distribution of the samples at the phylum level

圖3 屬水平細(xì)菌聚類熱圖Fig.3 Heatmap at genus level

2.4 PICRUSt基因預(yù)測

采用PICRUSt方法預(yù)測滇金絲猴潛在的腸道微生物基因功能，如圖4所示共獲得6大類功能(不包含未分類和未知的)：細(xì)胞工程、環(huán)境信息處理、遺傳信息工程、人類疾病、代謝作用、有機(jī)體系統(tǒng)?；蝾A(yù)測熱圖結(jié)果表明各樣品的基因功能存在一定差異，其中R1腸道微生物在遺傳信息工程方面的功能較豐富，R4在代謝作用上的功能較豐富，R5在有機(jī)體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、細(xì)胞工程和人類疾病方面的功能較豐富，R2和R3腸道微生物的各功能豐富度較相似。同時，比較功能基因所在KEGG通路上的豐度差異(圖5)，在各大類功能中豐度最高的分別為：細(xì)胞遷移、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA的復(fù)制與修復(fù)、傳染病、碳水化合物代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)。

圖4 PICRUSt基因預(yù)測聚類熱圖Fig.4 Heatmap of PICRUSt gene predicted function

圖5 KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計圖Fig.5 Statistical chart of predicted results from KEGG database

3 討論

本試驗采集了4只健康滇金絲猴糞樣和1只亞健康滇金絲猴糞樣，利用Illumina MiSeq高通量測序分析后共鑒定出12個門、19個綱、31個目、47個科、82個屬和65個種。通過稀釋曲線、Rank abundance曲線和Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行樣本的復(fù)雜度分析，測序深度已基本覆蓋腸道內(nèi)所有細(xì)菌，且各組樣品豐富度和均勻度較好，克服了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法難以培養(yǎng)厭氧細(xì)菌、耗時、數(shù)據(jù)不全面等缺點(diǎn)。5只滇金絲猴腸道微生物的種類和數(shù)量不完全相同，可能是動物的生理狀況有一定差異所致。

研究發(fā)現(xiàn)健康滇金絲猴腸道共同優(yōu)勢菌群有：厚壁菌門(78.41%)、擬桿菌門(18.97%)，與先前的研究結(jié)果相似：非人靈長類動物腸道的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門(65%—79%)、擬桿菌門(5.5%—19.3%)[3]。中國恒河猴(Macacamulatta)的腸道優(yōu)勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)和螺旋體門[4]，神農(nóng)架川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)的優(yōu)勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門[5]，川金絲猴優(yōu)勢菌群有：厚壁菌門(70.35%)、擬桿菌門(21.35%)[6]，這一結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于滇金絲猴和恒河猴、神農(nóng)架川金絲猴的飲食結(jié)構(gòu)和生存環(huán)境存在差異[7]。此外，科學(xué)家通過溫度梯度凝膠電泳(TGGE)比較野生和圈養(yǎng)的大猩猩(Gorillagorilla)腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)和野生的同一種靈長類動物其腸道菌群的多樣性存在差異[8]。

厚壁菌門和擬桿菌門是人和非人靈長類動物腸道共同的優(yōu)勢菌門[9]，可降解食物中難分解的成分[10]。非人靈長類動物腸道中2者所占比例之和為70.50%—98.30%[3]。高比例的厚壁菌門會導(dǎo)致腸道吸收卡路里的效率升高，促進(jìn)機(jī)體肥胖[11]。在滇金絲猴腸道中，擬桿菌門所占的比例越高，動物健康狀況越好[12]。此外，豐度前10的還有纖維桿菌門(Fibrobacteres)，該菌門能消化纖維素，常存在于反芻動物的瘤胃中[13]。這一菌群的出現(xiàn)解釋了滇金絲猴作為植食性動物的消化機(jī)制，暗示其腸道菌群組成與反芻動物菌群組成有相似之處[14]。本研究中亞健康滇金絲猴的優(yōu)勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、變形菌門，其中螺旋體門和變形菌門的含量較健康滇金絲猴顯著增加。螺旋體門和變形菌門都分別包括多種致病菌，如：螺旋體(Spirochaeta)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)等[15-16]，降低動物腸道中螺旋體門和變形菌門的比例，個體的健康狀況可能會得到進(jìn)一步改善。在屬水平上，瘤胃球菌屬占有較高比例，助于細(xì)胞吸收糖分，利于食物的消化吸收[17]。毛螺菌科(Lachnospiraceae)的細(xì)菌參與纖維素的降解[18]，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體及腸道微生物提供能量。研究顯示，草食動物腸道內(nèi)包括毛螺旋菌科、纖維桿菌屬(Cellulosimicrobium)等細(xì)菌與其食草特性相關(guān)[19-20]。本次試驗中，健康滇金絲猴腸道中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)含量較低(豐度未進(jìn)前10)，但普氏菌屬(Prevotella)含量較高，其可作為益生菌替代菌分解食物中的糖類[3]。腸道中的擬桿菌屬(Bacteroides)有助于碳水化合物的分解。R5滇金絲猴腸道中毛螺菌科成員含量較低，但其含有的優(yōu)勢菌群梭菌屬(Clostridum)和厭氧原體屬(Anaeroplasma)都與纖維素降解有關(guān)[21]；琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)可利用糖分解產(chǎn)生的有機(jī)酸，使胃中產(chǎn)生的有機(jī)酸不會積聚，但其在R5中大量出現(xiàn)的原因有待探討。雖然R5與R1—R4的優(yōu)勢菌群有所差異，但這些菌群都具有同一作用：參與纖維素的降解，造成這一差異的原因可能與動物的個體和飲食有關(guān)。滇金絲猴常攝入纖維素含量較高的植物，通過分析其腸道菌群的組成，發(fā)現(xiàn)滇金絲猴腸道微生物種類與其食性是密切相關(guān)的。

腸道微生物與機(jī)體的免疫功能、消化和吸收、酶代謝作用等有關(guān)[22]。研究表明，人類腸道中微生物失衡可導(dǎo)致過敏[23]、肥胖[24]和糖尿病等[25]。由此可見，腸道微生物對機(jī)體的生理功能有一定的影響。PICRUSt將不可視的微生物，通過與數(shù)據(jù)庫比對和生物功能聯(lián)系起來。PICRUSt基因預(yù)測熱圖顯示，相同功能各樣品間熱圖顏色不同，說明各樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個樣品中所含微生物的種類和數(shù)量有區(qū)別，導(dǎo)致各樣品的效能存在差異。PICRUSt基因預(yù)測表明滇金絲猴腸道中大部分細(xì)菌與機(jī)體代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和遺傳信息處理功能有關(guān)。腸道菌群與宿主同步進(jìn)化，以微妙的方式影響宿主，適應(yīng)不同的生理和病理狀態(tài)。破壞正常菌群的結(jié)構(gòu)可能會對這些代謝通路產(chǎn)生阻礙。數(shù)以萬億的細(xì)菌棲息在動物腸道內(nèi)，反映了個體健康、亞健康、疾病狀況和疾病轉(zhuǎn)歸[26]，由于人類對腸道菌群基因組的認(rèn)識有限，此次試驗尚有部分基因和功能未知，未來我們會針對性的研究患病和健康個體，以期發(fā)現(xiàn)腸道菌群變化與疾病之間的潛在關(guān)系。

4 小結(jié)

本研究得到圈養(yǎng)條件下成年健康滇金絲猴的菌群結(jié)構(gòu)，為滇金絲猴疾病監(jiān)測及人工飼料的研究提供數(shù)據(jù)，以期在對滇金絲猴腸道菌群實時監(jiān)測的過程中改善其腸道微生物，達(dá)到保護(hù)和增殖瀕危動物的目的。