張飛燕 金 潔 劉 超 胡正飛 張玉林 謝麗分 鄔繼文 呂龍寶，2*

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明，650000；2.中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心，昆明，650223)

食蟹猴(Macacafascicularis)又名長(zhǎng)尾猴或爪哇猴，體型較獼猴為小，性情比較溫順，毛色由黃褐色或灰色到暗灰色，腹部顏色略淺。尾長(zhǎng)與體長(zhǎng)相近似或略長(zhǎng)。食蟹猴作為非人靈長(zhǎng)類的近親，與人類的遺傳物質(zhì)高度同源，同源性達(dá) 75%—98.5%，在組織結(jié)構(gòu)、生理和代謝功能等許多方面顯示出與人類相似的特征，是理想的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，所獲得的數(shù)據(jù)和資料更能準(zhǔn)確反映其疾病的自然性，而且能夠使研究者從病因、發(fā)病機(jī)理、臨床癥狀等方面對(duì)疾病進(jìn)行更廣泛和深入的研究[1-3]。近年來(lái)，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理學(xué) 、病毒學(xué)等方面的研究[4]。

在人工圈養(yǎng)猴場(chǎng)中，腹瀉是食蟹猴最常見(jiàn)的疾病，腹瀉主要是指猴子大便次數(shù)增多及糞質(zhì)稀薄呈稀便、水樣便而言，引起腹瀉的因素很多，但具體原因尚未確定。腹瀉與腸道菌群多樣性的變化有關(guān)。許多研究報(bào)道腸道菌群有助于維持宿主的健康，它們對(duì)宿主的生理，能量代謝起重要作用，并影響免疫系統(tǒng)[5-6]。既往研究報(bào)道了腹瀉食蟹猴的病原菌分離鑒定。然而，對(duì)于利用高通量測(cè)序手段對(duì)健康和腹瀉食蟹猴的細(xì)菌微生物多樣性知之甚少。因此，本研究利用高通量測(cè)序手段對(duì)云南健康和腹瀉食蟹猴的糞便菌群微生物多樣性進(jìn)行了初步比較分析，探討腹瀉與食蟹猴糞便菌群關(guān)系，為食蟹猴的預(yù)防及相關(guān)微生態(tài)制劑的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采取飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類中心普通級(jí)環(huán)境(SCXK(滇)K2017-003)的6只成年腹瀉雄性食蟹猴和6只成年健康雄性食蟹猴的糞便，準(zhǔn)備好糞便容器，帶上無(wú)菌手套收集新鮮糞便樣本立刻放到冰上，用糞便取樣器截取樣品中段里部2 g左右，健康組編號(hào)HM1—HM6、腹瀉組編號(hào)DM1—DM6，迅速放到液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱待檢查。采樣過(guò)程在糞便排泄6 min內(nèi)完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心進(jìn)行(SYXK(滇)K2017-0008。

1.2 主要試劑和儀器

Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，高效高保真酶(New England Biolabs 公司)，膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；PCR儀：ABI GeneAmp?9700型。

1.3 細(xì)菌總DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用SDS方法對(duì)12個(gè)樣本的DNA進(jìn)行提取，之后用脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，針對(duì)16S RNA的V3—V4區(qū)(338F-806R)，使用帶 Barcode 的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。使用Thermo GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific 公司)回收。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序工作在諾禾致源完成。

1.5 生物信息分析流程

測(cè)序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理得到Clean Reads，將所有樣品的Clean Reads按97%的一致性將序列聚類成為OTUs，OTU聚類分析，進(jìn)行樣品復(fù)雜性分析(計(jì)算Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Sobs指數(shù)和覆蓋指數(shù)(Coverage)等多樣性指數(shù)。每個(gè)樣本都做了稀釋性曲線和Shannon指數(shù)曲線。并從各個(gè)分類水平上進(jìn)行健康組與腹瀉組兩組之間優(yōu)勢(shì)菌群和差異菌群組成分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 測(cè)序水平

本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)健康食蟹猴和腹瀉食蟹猴糞便共12個(gè)樣本的V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序研究，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化分析，健康組共得到432 276條有效序列，每個(gè)樣本的有效序列都超過(guò)60 000條，平均每個(gè)樣本獲得72 046條。腹瀉組共有473 090條有效序列，每個(gè)樣本的有效序列都超過(guò)70 000條，平均每個(gè)樣本獲得78 848條。這些序列共分屬于14個(gè)門(mén)、23綱、44目、77科、160屬、142種。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)按97%的相似水平進(jìn)行聚類分析，健康組平均每個(gè)樣本獲得672個(gè)OTU，腹瀉組平均每個(gè)樣本獲得509個(gè)OTU。

2.2 樣品的復(fù)雜度分析

基于OUT聚類分析結(jié)果，通過(guò)樣品稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線分析(圖1)，12個(gè)樣品稀釋曲線隨著測(cè)序量數(shù)據(jù)的增加曲線趨向平坦，并且覆蓋度good’s coverage達(dá)到99.97%，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種(OTUs)，目前的測(cè)序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。兩組樣本檢測(cè)到的OTU豐富度Chao指數(shù)(700.446±41.123 vs.543.229±90.379，P<0.05)、Ace指數(shù)(707.902±38.843 vs.546.624±93.145，P<0.05)、Shannon指數(shù)(6.511± 0.265 vs.6.125± 1.071，P>0.05)、Simpson指數(shù)(0.970±0.007 vs.0.960±0.039，P>0.05)。通過(guò)Shannon、Simpson指數(shù)分析，腹瀉組的糞便微生物多樣性下降但差異不顯著，通過(guò)Chao指數(shù)、Ace指數(shù)分析，腹瀉組的微生物群落豐富度顯著下降(表1)。通過(guò)Venn圖分析健康組和腹瀉組共有771個(gè)OTU，健康組獨(dú)有168個(gè)OTU，腹瀉組獨(dú)有125個(gè)OTU。

基于PCA主成分分析，圖中正方形和圓形分別表示來(lái)源為健康與腹瀉食蟹猴糞便樣本，第一個(gè)主坐標(biāo)(PC1)捕獲了33.8%的變異，第二個(gè)主坐標(biāo)(PC2)捕獲了14.4%的變異，健康組與腹瀉組各聚在一邊(圖2)。PCA結(jié)果表明，健康食蟹猴和腹瀉食蟹猴的細(xì)菌群落組成存在明顯差異。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Shannon rarefaction curves

圖2 韋恩圖Fig.2 Venn graph

圖3 PCA分析Fig.3 PCA analysis

表1 Alpha 多樣性指數(shù)分析Tab.1 Alpha diversity

注：分析方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著水平為 0.05；數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差
Note：The analysis method used independent samplettest，and the significance level was 0.05.Data were taken as mean standard deviation

2.3 在不同分類水平上優(yōu)勢(shì)菌群組成分析

在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為2大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。厚壁菌門(mén)在健康組和腹瀉組的平均含量為55.85%和46.82%，擬桿菌門(mén)在健康組和腹瀉組的平均含量為39.96%和45.4%。其次豐度大于1%的門(mén)健康組有螺旋體門(mén)(Spirochaetae)，腹瀉組有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、螺旋體門(mén)。

在屬水平上乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、未分類的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)為主要菌屬，其中乳酸桿菌屬在健康組的平均含量為13.42%，明顯高于腹瀉組(2.77%)，鏈球菌屬在健康組的平均含量5.52%高于腹瀉組3.82%，未分類的普雷沃氏菌科unidentified Prevotellaceae在健康組的平均含量6.13%大于腹瀉組3.73%。

2.4 物種組成差異比較分析

通過(guò)MetaStat方法研究組間具有顯著性差異的物種，從不同層級(jí)的物種豐度表出發(fā)，展示不同分類水平具顯著差異top10的物種。在門(mén)水平上，健康組與腹瀉組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)都為厚壁菌門(mén)，門(mén)之間沒(méi)有顯著差異。在綱水平上，健康組芽孢桿菌綱(Bacilli)的平均含量19.03%顯著高與腹瀉組的7.7%(P<0.05)。在目水平上，健康組乳酸桿菌目(Lactobacillales)平均含量(19.03%)顯著高于腹瀉組(7.7%)(P<0.05)，慢生單胞菌目(Bradymonadales)只存在腹瀉組中。在科水平上健康組的乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)平均含量13.42%顯著高于腹瀉組的2.7%。在屬水平上，乳酸桿菌屬和罕見(jiàn)小球菌屬(Subdoligranulum)在健康組腹瀉組中差異顯著，乳酸桿菌屬在健康組中平均含量為13.42%顯著高于腹瀉組的2.7%(P<0.05)，罕見(jiàn)小球菌屬在腹瀉中的平均含量1.9%顯著高于健康組0.6%(P<0.05)。

另外通過(guò)LEfSe(LDA Effect Size)分析(LDA閾值為1)，乳酸桿菌目，芽孢桿菌綱，乳酸桿菌科，乳酸桿菌屬，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)在健康組中顯著富集，彎曲桿菌科(Campylobacteraceae)彎曲桿菌屬(Campylobacter)在腹瀉組顯著富集。

圖4 在門(mén)水平上的菌群組成Fig.4 Community analysis pieplot on phylum level

圖5 在屬水平上的菌群組成Fig.5 Community analysis pieplot on genus level

表2 MetaStat分析組間差異顯著的種Tab.2 Comparison of microbial community structure in phylum level in diffrent groups by Metastats

圖6 LEfSe(LDA Effect Size)分析圖Fig.6 LEfSe analysis of different species

3 討論

食蟹猴是自然界中較為常見(jiàn)的一種猴，主要分布在泰國(guó)、老撾、馬來(lái)西亞等國(guó)家的熱帶雨林。由于生活環(huán)境的改變使得表現(xiàn)為腹瀉的慢性腸炎成為飼養(yǎng)食蟹猴最常見(jiàn)的疾病。造成腹瀉的原因有很多，細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲(chóng)感染、食物毒素污染和消化不良等均是腹瀉的常見(jiàn)病因。中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心檢疫、飼養(yǎng)等均十分專業(yè)，在排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、結(jié)核感染的養(yǎng)殖食蟹猴中，更排除了飼養(yǎng)條件造成的失誤。除了動(dòng)物生活環(huán)境的改變，并未發(fā)現(xiàn)明顯異常。對(duì)飼養(yǎng)食蟹猴腹瀉病原微生物方面的檢測(cè)，并不能證明其與特定的病原微生物相關(guān)，抗生素雖在短期內(nèi)可緩解腹瀉癥狀，但從整個(gè)慢性病程看，并無(wú)效。無(wú)論何種原因造成的腹瀉，腸道菌群都出現(xiàn)嚴(yán)重的比例失調(diào)。

動(dòng)物的消化道擁有一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，被稱為微生物群，宿主自身需要依賴微生物菌群的協(xié)助，才能降解食物中的纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)，它們對(duì)宿主的生理、能量代謝起重要作用，并影響免疫系統(tǒng)[7-8]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)健康和腹瀉食蟹猴糞便菌群進(jìn)行差異分析。本試驗(yàn)的Shannon 稀釋曲線趨近平緩及本試驗(yàn)的覆蓋度(good’s coverage)達(dá)到99.99%，說(shuō)明了對(duì)所取樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和。目前的測(cè)序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。通過(guò)Venn圖分析，健康組與腹瀉組共有771個(gè)OTU，健康組獨(dú)有168個(gè)OTU，腹瀉組獨(dú)有125個(gè)OTU。通過(guò)對(duì)健康組與腹瀉組食蟹猴Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，腹瀉食蟹猴糞便菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，但這種結(jié)構(gòu)改變?cè)谖⑸锒鄻有灾笖?shù)方面沒(méi)有表現(xiàn)出顯著地差異(P>0.05)，這與王劍等報(bào)道的健康與腹瀉川金絲猴細(xì)菌微生物多樣性差異結(jié)果一致[9]。在群落豐富度指數(shù)方面表現(xiàn)出顯著地差異(P<0.05)，腹瀉組的菌群豐富度顯著下降。這和通常認(rèn)為的腹瀉發(fā)生后腸道微生物結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單的結(jié)論相符[10]。從PCA主成分分析結(jié)果圖中可以看出，健康組(HM1—HM6)與腹瀉組(DM1—DM6)2組樣本形成明顯的2個(gè)族，表明健康組與腹瀉組的菌群是存在差異的。

通過(guò)對(duì)健康組與腹瀉組的物種組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腹瀉組食蟹猴的糞便中有益菌屬乳酸桿菌屬明顯下降，致病菌屬?gòu)澢鷹U菌屬(Campylobacter)在腹瀉組中顯著升高。周勤等[11]報(bào)道的采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)調(diào)查食蟹猴中彎曲桿菌感染的陽(yáng)性率較高為57.48%，主要為空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和大腸桿菌(Escherichiacoli)，且通過(guò)比較不同養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)猴彎曲桿菌的感染率發(fā)現(xiàn)彎曲菌適于潮濕的環(huán)境條件，說(shuō)明彎曲菌可以通過(guò)改善飼養(yǎng)環(huán)境來(lái)進(jìn)行控制。從而推斷腹瀉樣本中是由于有益菌屬乳酸桿菌屬定植減少，致病菌屬?gòu)澢鷹U菌屬增多，致使菌群失調(diào)。乳酸桿菌被視為動(dòng)物胃腸道中重要的益生菌，擁有多種消化酶完善機(jī)體消化功能，同時(shí)通過(guò)代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等降低環(huán)境pH值，從而抑制腐敗細(xì)菌及有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[12]。彎曲桿菌屬是一類主要寄存在哺乳動(dòng)物和禽類腸道中的革蘭氏陰性桿菌，該屬中的空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)、胎兒彎曲菌(Campylobacterfetus)等可通過(guò)直接接觸和食品污染而使人類致病。并且目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到空腸彎曲桿菌在世界范圍內(nèi)是引起人類細(xì)菌性胃腸炎的一個(gè)最主要致病因素。人感染該菌后主要表現(xiàn)為急性腸炎，如出現(xiàn)腹瀉、不適、發(fā)熱、腹痛和血便等癥狀[13-14]。由彎曲菌引起的腹瀉與沙門(mén)氏菌(Salmonella)引起的腹瀉同樣普遍，并已超過(guò)了志賀氏菌(Shigella)引起的腹瀉。這將對(duì)飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)人員的健康構(gòu)成威脅，因此我們應(yīng)加強(qiáng)工作人員防護(hù)，并從改善飼養(yǎng)環(huán)境入手，降低或消除實(shí)驗(yàn)猴彎曲菌感染 。

目前已有報(bào)道通過(guò)飲食添加益生菌、益生元達(dá)到治療和預(yù)防腹瀉等IBS疾病(腸易激綜合征)已取得顯著成效[15-17]。尤其是增加日糧中膳食纖維含量，調(diào)節(jié)腸道微生物中雙歧桿菌(Bifidobacterium)數(shù)量，達(dá)到治療和預(yù)防腹瀉等IBS病的目標(biāo)。能否通過(guò)添加微生態(tài)制劑，或調(diào)整圈養(yǎng)食蟹猴飼糧結(jié)構(gòu)，尤其是增加纖維含量，達(dá)到降低食蟹猴胃腸道疾病的發(fā)生，提高食蟹猴的品質(zhì)。未來(lái)在食蟹猴益生菌研究及腹瀉防治方面還需進(jìn)一步的研究。