張建龍，王亞妮，董樂(lè)輝，陳國(guó)忠*，姜琳琳，于馨，朱洪偉，鄭維波，劉燕

試驗(yàn)研究

短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵對(duì)豬糞細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

張建龍1,2,3，王亞妮1，董樂(lè)輝4，陳國(guó)忠1,2,3*，姜琳琳1,2,3，于馨1,2,3，朱洪偉1,2,3，鄭維波1,2,3，劉燕1,2,3

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.山東省養(yǎng)殖環(huán)境控制工程實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái)；3.煙臺(tái)市動(dòng)物病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái)；4.山東益生種畜禽股份有限公司，山東 煙臺(tái)）

為了研究畜禽糞便固態(tài)發(fā)酵前后微生物的變化，采用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)可操作分類(lèi)單元分析、α多樣性分析和物種組成分析，比較了豬糞短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵前后的細(xì)菌群落組成，結(jié)果表明，發(fā)酵前后可操作分類(lèi)單元總數(shù)分別為151個(gè)和126個(gè)，發(fā)酵后細(xì)菌群落多樣性指數(shù)降低；發(fā)酵前相對(duì)豐度最高的分別是變形菌門(mén)59.48 %、擬桿菌門(mén)23.97 % 和厚壁菌門(mén)13.79 %，發(fā)酵后變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)分別減少至0.66 % 和1.00 %，而厚壁菌門(mén)增加至99.01 %，是發(fā)酵豬糞的優(yōu)勢(shì)菌群。本研究表明發(fā)酵后豬糞細(xì)菌群落多樣性下降，抗生素抗性基因潛在攜帶者相對(duì)豐度降低，耐高溫的有機(jī)質(zhì)降解菌成為優(yōu)勢(shì)菌屬，該研究對(duì)豬糞的資源化處理具有理論指導(dǎo)意義。

豬糞；高通量測(cè)序；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致畜禽糞便大量堆積，嚴(yán)重污染環(huán)境[1]。豬糞中含有大量的病原微生物，處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致對(duì)環(huán)境的二次污染[2]，暴發(fā)大規(guī)模的傳染性疾病[3]。高溫好氧堆肥可防止抗生素、抗生素抗性基因和抗性細(xì)菌從糞肥釋放到農(nóng)田土壤中[4]，改善土壤，提高農(nóng)作物產(chǎn)量[5]。在高溫好氧堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著的變化[6]。據(jù)報(bào)道Kato等[7]研究發(fā)現(xiàn)堆肥加速了牛糞中微生物群落的演替，使微生物豐富度下降的同時(shí)保持了微生物的多樣性。Mao等[8]在研究堆肥前后豬糞中微生物的群落演替時(shí)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)是嗜熱階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，保持良好的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)豬糞堆肥起到了重要的指導(dǎo)性作用。

高通量測(cè)序技術(shù)能夠通過(guò)從環(huán)境樣本中直接獲取總的DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，從而提高測(cè)序效率[9]。本研究采用高通量測(cè)序的手段，對(duì)短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵前后的豬糞進(jìn)行微生物多樣性分析，闡明短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵前后豬糞細(xì)菌群落及物種的組成和相對(duì)豐度，進(jìn)而可以確定豬糞發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，并通過(guò)對(duì)比總結(jié)出豬糞發(fā)酵前后細(xì)菌群落的演替規(guī)律，對(duì)豬糞發(fā)酵制備有機(jī)肥的資源化處理技術(shù)具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

豬糞由養(yǎng)殖戶提供，發(fā)酵菌劑AT酵素由百威國(guó)際生物股份有限公司提供，花生殼粉采購(gòu)自煙臺(tái)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵 將豬糞和花生殼粉按比例混拌均勻，碳氮比調(diào)節(jié)為25:1，控制含水量60 %，從不同位點(diǎn)隨機(jī)采樣5份，合并為1份，記為BEFE，作為發(fā)酵前樣本。將物料加入百威高速發(fā)酵設(shè)備（百威國(guó)際生物股份有限公司）內(nèi)，每1 t原料添加1 kg發(fā)酵菌劑，啟動(dòng)電源加熱至50 ℃，啟動(dòng)攪拌每1 h轉(zhuǎn)1圈，曝氣速率為15 L/min。發(fā)酵10 h后加熱至80 ℃ 維持1 h，加熱至100 ℃ 再維持1 h，結(jié)束發(fā)酵，出料，在室外建成一個(gè)長(zhǎng)2 m、寬1 m、高0.8 m的堆體，每天進(jìn)行1～2次翻堆，腐熟6 d。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，在堆肥不同位點(diǎn)隨機(jī)采集樣品5份，合并為1份，記為AEFE，作為發(fā)酵后樣本。每個(gè)樣本采集3份，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高通量測(cè)序 將樣品送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，測(cè)序引物515F/907R，序列為515F：5'-GTGCCA GCMGCCGCGG-3'，907R：5'-CCGTCAATTCM TTTRAGTTT-3'，測(cè)序的區(qū)域是V4-V5區(qū)，測(cè)序平臺(tái)是Illumina Miseq。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)得到的測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選處獲得優(yōu)化序列，然后在97 % 的相似水平上進(jìn)行可操作分類(lèi)單元聚類(lèi)分析，用Mothur軟件計(jì)算得到豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和覆蓋率，利用R語(yǔ)言工具分析樣本在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)。用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異結(jié)果表示為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 豬糞樣品的測(cè)序質(zhì)量

通過(guò)引物對(duì)樣品的16S進(jìn)行測(cè)定，豬糞發(fā)酵前后高通量測(cè)序總的堿基數(shù)分別為70 750和80 333，其中合并的堿基數(shù)分別為66 493和75 328，各占所測(cè)堿基總數(shù)的93.98 % 和93.77 %。從序列長(zhǎng)度來(lái)看，所測(cè)序列長(zhǎng)度分別在264 bp ～ 402 bp和265 bp ～ 394 bp之間，平均測(cè)序長(zhǎng)度為372 bp和371 bp。

2.2 豬糞樣品菌群的α多樣性

2.2.1 稀釋曲線 為了判斷本樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，筆者對(duì)發(fā)酵前后豬糞的測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，然后利用稀釋曲線進(jìn)行評(píng)估。發(fā)酵后和發(fā)酵前的曲線隨著測(cè)序深度的增加最終接近平臺(tái)期趨于平穩(wěn)，說(shuō)明本次取樣的合理性，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋樣本中的所有物種。

2.2.2 群落多樣性指數(shù) 香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)代表了微生物的多樣性。由表1可以看出發(fā)酵后細(xì)菌群落的香農(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)相比于發(fā)酵前降低了，表明發(fā)酵后豬糞的物種多樣性下降但是群落分布多樣性卻有微量的增長(zhǎng)。發(fā)酵后的豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)明顯低于發(fā)酵前，這說(shuō)明發(fā)酵后的豬糞中物種豐富度顯著降低。發(fā)酵前細(xì)菌可操作分類(lèi)單元為151個(gè)，發(fā)酵后細(xì)菌可操作分類(lèi)單元為126種，兩種狀態(tài)下都存在的為85種，表明發(fā)酵前后的細(xì)菌類(lèi)別存在較大差異。

表1 群落多樣性指數(shù)

注：*表示差異顯著（<0.05）

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 在門(mén)水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 高通量測(cè)序結(jié)果表明（表2），發(fā)酵前豬糞細(xì)菌群落在門(mén)水平上的主要類(lèi)群為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為59.48 %、23.97 %、13.79 %、2.55 %。變形菌門(mén)是其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。發(fā)酵后厚壁菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，并且占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到99.01 %。

表2 發(fā)酵前后細(xì)菌在門(mén)水平的相對(duì)豐度

表3 發(fā)酵前后細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度

2.3.2 在屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 由表3可見(jiàn)，發(fā)酵前在屬水平上相對(duì)豐度排名前7的菌屬為不動(dòng)桿菌屬40.85 %、香味菌屬17.58 %、毛球菌屬7.88 %、橄欖桿菌屬4.19 %、弧菌屬3.65 %、假單胞菌屬3.63 %、腸球菌屬2.63 %。發(fā)酵后這7個(gè)屬的相對(duì)豐度值都顯著降低，尤其是優(yōu)勢(shì)菌屬不動(dòng)桿菌屬在發(fā)酵后相對(duì)豐度僅為0.66 %，遠(yuǎn)低于發(fā)酵前。嗜熱糞桿菌屬、中度嗜熱微菌屬和中度嗜熱厭氧菌屬成為發(fā)酵后的優(yōu)勢(shì)菌屬，占比分別達(dá)到66.95 %、7.41 % 和4.35 %。

2.3.3 細(xì)菌群落各分類(lèi)單元占比差異 對(duì)發(fā)酵前后豬糞細(xì)菌群落各分類(lèi)單元的分布差異進(jìn)行了分析，發(fā)酵前細(xì)菌在綱、目、科、屬中的分布廣泛，發(fā)酵后則主要集中于厚壁菌門(mén)梭菌綱。發(fā)酵前豬糞中的細(xì)菌主要分布在變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，發(fā)酵后則是厚壁菌門(mén)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。對(duì)于厚壁菌門(mén)而言，發(fā)酵前僅有芽孢桿菌綱乳桿菌目的肉桿菌科、氣球菌科和腸球菌科。發(fā)酵后的豬糞細(xì)菌群落中有芽孢桿菌綱乳桿菌目的肉桿菌科、腸球菌科、乳酸細(xì)菌科和芽孢桿菌目，以及梭菌綱的梭菌目和鹽厭氧菌目。

3 討論

（1）采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵對(duì)豬糞細(xì)菌多樣性的影響。樣品的稀釋曲線末端趨于平坦說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是足夠的。發(fā)酵后豬糞中細(xì)菌的多樣性下降，其原因在于短時(shí)高溫好氧發(fā)酵的溫度高于50 ℃ 甚至達(dá)到80～100 ℃，在此階段大多數(shù)微生物因?yàn)槟蜔嵝暂^差而失活[10]，嗜熱細(xì)菌生存下來(lái)成為優(yōu)勢(shì)菌群[8]。（2）通過(guò)種群結(jié)構(gòu)分析，豬糞發(fā)酵前后細(xì)菌群落變化顯著，發(fā)酵前厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是堆肥微生物區(qū)系中占主導(dǎo)地位的門(mén)類(lèi)，發(fā)酵后厚壁菌門(mén)成為了豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)且占比超過(guò)99 %，該結(jié)果與王旭輝等[11]報(bào)道的牛糞堆肥過(guò)程中微生物的變化是一致的。動(dòng)物糞便是人畜共患病原體的主要來(lái)源，其中的變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的門(mén)，含有大量的病原性菌種。發(fā)酵前變形菌門(mén)是豬糞細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，符合畜禽腸道微生物菌落的一般規(guī)律。大多數(shù)病原菌在50 ℃ 以上24 h內(nèi)就會(huì)被滅活，因此豬糞中的病原菌經(jīng)過(guò)高溫發(fā)酵后絕大部分被殺死，原來(lái)占優(yōu)勢(shì)的變形菌門(mén)在發(fā)酵后僅占細(xì)菌總數(shù)0.66 %。變形菌門(mén)中很多菌種是抗生素抗性基因的攜帶者，變形菌門(mén)豐度降低和抗生素抗性基因的消除具有一定的相關(guān)性[12-13]。發(fā)酵后厚壁菌門(mén)成為豬糞中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其原因是多方面的。首先，厚壁菌門(mén)細(xì)胞壁的肽聚糖含量約在50 % ～ 80 %之間，細(xì)胞壁較厚具有較強(qiáng)的耐熱性；其次，發(fā)酵菌劑大多為厚壁菌門(mén)菌種，其本身就是優(yōu)勢(shì)菌群；最后，厚壁菌門(mén)能利用現(xiàn)成可發(fā)酵的碳水化合物并參與纖維素外圍側(cè)鏈的初始定植[14]，同時(shí)分泌多種果膠酶來(lái)完成降解纖維素等難消化的碳水化合物的目的，發(fā)酵過(guò)程中加入的輔料是含有大量木質(zhì)素和纖維素為主要成分的花生殼，對(duì)厚壁菌門(mén)具有促生作用。此外，豬糞中氮源含量高，而厚壁菌門(mén)具有能夠利用氮源和促進(jìn)氨基酸運(yùn)輸代謝的能力[15]，這也是厚壁菌門(mén)成為優(yōu)勢(shì)菌群的主要原因之一。（3）從屬水平分析可知，發(fā)酵前不動(dòng)桿菌屬、香味菌屬、毛球菌屬、橄欖桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、腸球菌屬7個(gè)相對(duì)豐度較高的菌屬在發(fā)酵后都顯著降低，嗜熱糞桿菌屬、中度嗜熱微菌屬和中度嗜熱厭氧菌屬成為發(fā)酵后的優(yōu)勢(shì)菌屬。已有報(bào)道表明畜禽糞便中磺酰胺類(lèi)抗生素抗性基因的相對(duì)豐度較高[16]，而不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬被認(rèn)為是主要載體[17]，這兩個(gè)菌屬在發(fā)酵后豐度降低有利于抗生素抗性基因的消減，即有利于畜禽糞便的無(wú)害化。嗜熱糞桿菌屬、中度嗜熱微菌屬和中度嗜熱厭氧菌屬在纖維素和有機(jī)物的降解中起主導(dǎo)作用[18-21]，都屬于嗜熱菌，這可能是這三類(lèi)菌高溫發(fā)酵后在豬糞的微生物菌落中成為優(yōu)勢(shì)菌種的主要原因。（4）本研究對(duì)采用短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵前后的豬糞樣本進(jìn)行了高通量測(cè)序，通過(guò)可操作分類(lèi)單元分析、α多樣性分析和物種組成分析發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵后豬糞細(xì)菌群落物種多樣性下降，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增加成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，抗生素抗性基因攜帶者不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬相對(duì)豐度降低，耐高溫的有機(jī)質(zhì)降解菌嗜熱糞桿菌屬、中度嗜熱微菌屬和中度嗜熱厭氧菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬。發(fā)酵前后豬糞細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化主要與發(fā)酵溫度、輔料和發(fā)酵菌劑特性有關(guān)，短時(shí)高溫好氧固態(tài)發(fā)酵能夠有利于豬糞無(wú)害化處理。

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系（SDAIT-13-011-10）；山東省重大科技創(chuàng)新工程（2017GGH5129）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；煙臺(tái)市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YT06000636）

（2021–02–08）

S852.6

A

1007-1733（2021）05-0001-04