李萍 陳偉 黃航

[摘要] 目的 研究LncRNA SChLAP1調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。 方法 采用慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，并用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染率;利用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞的凋亡情況，通過(guò)生物信息學(xué)確定其下游的可能靶點(diǎn)。 結(jié)果 在不同靶點(diǎn)病毒作用下PC-3細(xì)胞可以下調(diào)SChLAP1的表達(dá)，其中3#位點(diǎn)的下調(diào)效率最大達(dá)40%。PC-3細(xì)胞下調(diào)后，與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡比例明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 SChLAP1可以調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，而miR-101-5p是其下游的靶點(diǎn)之一。

[關(guān)鍵詞] 前列腺癌;LncRNA;SChLAP1;凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.25? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）16-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the possible molecular mechanism of LncRNA SChLAP1 in the regulation of apoptosis in prostate cancer cells. Methods Prostate cancer PC-3 cells were transfected with lentivirus， and the transfection rate was detected by qPCR. The apoptosis of PC-3 cells was detected by apoptosis detection kit， and the possible downstream targets were determined by bioinformatics. Results PC-3 cells could down-regulate the expression of SChLAP1 under the action of different target viruses， and the down-regulation efficiency of 3# locus was up to 40%. After PC-3 cells were down-regulated， the proportion of apoptosis was significantly higher than that of the negative control group， and there was a statistical difference. Conclusion SChLAP1 can regulate the apoptosis of prostate cancer cells， and miR-101-5p is one of its downstream targets.

[Key words] Prostate cancer; LncRNA; SChLAP1; Apoptosis

前列腺癌（prostate cancer，PC）是嚴(yán)重威脅全球男性的重要惡性腫瘤。在我國(guó)確診的老年男性人群中，其發(fā)病率暫時(shí)落后于西方，但卻多以腫瘤局部晚期甚至轉(zhuǎn)移為主，導(dǎo)致預(yù)后不佳。

LncRNAs是近來(lái)分子生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，已被證實(shí)參與多步驟基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。尤其在癌癥腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，lncRNAs參與調(diào)節(jié)重要細(xì)胞信號(hào)通路。Lnc SChLAP1（second chromosome locus associated with prostate-1）是由Prensner R和Iyer MK在2010年首先發(fā)現(xiàn)的，其與前列腺癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后緊密相關(guān)，并定位于細(xì)胞核[1]。研究中提示Lnc SChLAP1可以發(fā)揮促癌作用，其中一種機(jī)制是拮抗SWI/SNF復(fù)合物的核心蛋白[1]，但其在前列腺癌中其他機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人前列腺癌PC-3細(xì)胞株和人腎上皮293細(xì)胞株，均購(gòu)于上海生命研究院;胎牛血清、F-12K和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco公司（美國(guó)）;慢病毒顆粒、目的病毒Lenti-EGFP-SChLAP1-mir以及陰性對(duì)照病毒Lenti-EGFP均購(gòu)于上海銳賽科技有限公司（中國(guó)）;凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-APC-PI Apoptosis Analysis Kit）購(gòu)于三箭生物技術(shù)有限公司（中國(guó)）;Polybrene聚凝胺購(gòu)于上海索萊寶科技有限公司（美國(guó)）;雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司（美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞株的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

PC-3細(xì)胞株均使用F-12K培養(yǎng)基，293細(xì)胞株使用DMEM培養(yǎng)基，兩者均添入10%的胎牛血清（FBS）、1%鏈霉素和200 U/mL青霉素。兩株細(xì)胞置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建 LncRNA SChLAP1 穩(wěn)定下調(diào)前列腺癌細(xì)胞

將PC-3的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。加入相應(yīng)含量的目的病毒（滴度為4.36×108 TU/mL）和陰性對(duì)照病毒（滴度108 TU/mL，MOI=20），并依據(jù)病毒不同的滴度，向培養(yǎng)板中加入聚凝胺（8 μg/mL）增強(qiáng)病毒的感染效率。經(jīng)過(guò)感染孵育24 h后，將原含病毒的F-12K培養(yǎng)基替換為無(wú)病毒培養(yǎng)基，重置后再培養(yǎng)。再經(jīng)過(guò)孵育48 h后，通過(guò)查看GFP的水平，反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的SChLAP1表達(dá)。

1.4 SChLAP1下調(diào)后PC-3的凋亡水平檢測(cè)

用EP管收集培養(yǎng)板內(nèi)轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞的上清液，將上清液經(jīng)過(guò)1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，收集EP管底部的沉淀細(xì)胞。同時(shí)，用胰酶協(xié)助收集貼壁的細(xì)胞后，同轉(zhuǎn)速離心5 min，再收集細(xì)胞。每個(gè)組別均用500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，并慢慢吹打均勻。加入Annexin V（別藻青蛋白標(biāo)記）5 μL和碘化丙啶5 μL，混合均勻。在避光的條件下，室溫20°C孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 生物信息學(xué)檢測(cè)

利用TargetSCan human7.0 和starbase V2.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析查找目標(biāo)靶點(diǎn)。此項(xiàng)工作委托上海銳賽生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.6 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1.6.1 雙螢光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒的構(gòu)建? 通過(guò)螢光素酶報(bào)告載體 psiCHECK-2，構(gòu)建出野生型psiCHECK -SCHLAP1-wt-3UTR。 通過(guò)突變SChLAP1 3UTR 中與miR-101-5P互補(bǔ)的序列，從而構(gòu)建突變型 psiCHECK-SChLAP1-mu-3UTR。

1.6.2 細(xì)胞的分組、轉(zhuǎn)染和檢測(cè)? 實(shí)驗(yàn)報(bào)告采用293細(xì)胞系。分組信息如下：（1）空細(xì)胞組;（2）SChLAP1野生型組;（3）野生型+NC-mimic組;（4）SChLAP1野生型+miR101-mimic組;（5）SChLAP1突變組;（6）SChLAP1突變+NC-mimic組;（7）SChLAP1突變+miR101-mimic組。每組分別轉(zhuǎn)染3個(gè)復(fù)孔。

在轉(zhuǎn)染前24 h，使用胰酶消化293細(xì)胞后，接入24孔板（8 W個(gè)/孔）加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，先將培養(yǎng)基替換為不含抗生素的培養(yǎng)基，再安放于37°C適宜條件下進(jìn)行孵育，制作轉(zhuǎn)染的混合載體。 甲管：將含雙螢光素酶報(bào)告載體0.5 μg、不同組mimic 0.5 μL以及 25 μL培養(yǎng)基混勻;乙管： 25 μL轉(zhuǎn)染試劑與3 μL培養(yǎng)基混勻。在20℃條件下，靜置5 min，在不同組別甲管中加入乙管溶液。充分搖勻，在20℃條件下進(jìn)行孵育20 min。再取上述轉(zhuǎn)染混合載體，按各自的組別不同，分別滴入到相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板孔中，慢慢搖勻置于37°C培養(yǎng)箱中培育。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培育。48 h后，查看不同組別轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，上酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，多組采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同靶點(diǎn)下調(diào)PC-3細(xì)胞后SChLAP1基因的表達(dá)

與NC組相比，在三組不同靶點(diǎn)病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)后，1#、2#和3#號(hào)轉(zhuǎn)染組的PC-3細(xì)胞中SChLAP1表達(dá)均下降明顯，其中以3#組下降尤為明顯，下降達(dá)40%，并與NC組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P<0.05，**P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2 SChLAP1下調(diào)后PC-3的凋亡比例上升

PC-3細(xì)胞下調(diào)SChLAP-1后，細(xì)胞凋亡的比例明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（***P<0.001），見(jiàn)圖2。

2.3生物信息學(xué)檢測(cè)

利用TargetSCan human7.0 和starbase V2.0檢測(cè)，并結(jié)合文獻(xiàn)分析。在既往的報(bào)道中SChLAP1在前列腺癌中表現(xiàn)為高表達(dá)，其下游目標(biāo)基因?yàn)榈捅磉_(dá)。候選目標(biāo)基因有：miR-100、miR-21、miR-139、miR-25以及miR-21等基因。再通過(guò)人工比對(duì)的方式，初步選擇miR-101-5p 為SChLAP1可能的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3，可見(jiàn)兩者有8個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)。

2.4雙螢光素酶報(bào)告顯示SChLAP1可以靶向作用miR-101-5p

通過(guò)上調(diào)miR-101-5p 后，含有野生型 SChLAP1-wt-3UTR 的螢光素酶活性受到明顯的抑制，而同樣上調(diào)miR-101-5p對(duì)含有突變型 SChLAP1-mu-3UTR 的螢光素酶卻無(wú)法發(fā)揮抑制作用，見(jiàn)圖4。

3 討論

前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，其防治工作越來(lái)越重要。二代測(cè)序的不斷進(jìn)展后，在前列腺癌領(lǐng)域內(nèi)起重要作用的lncRNAs不斷的被發(fā)現(xiàn)和鑒定[2]。其中最具有代表性的是PCA3（Prostate cancer antigen 3），PCA3早在1995年就被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)其具有高度的前列腺癌特異性及檢驗(yàn)的便捷性，已被發(fā)展為前列腺癌重要的診斷方法。而其他LncRNAs如SChLAP1、SPRY4-IT1 和TRPM2-AS等不斷被發(fā)現(xiàn)、鑒定和驗(yàn)證，豐富了前列腺癌的診斷、治療和隨訪領(lǐng)域。但前列腺癌的發(fā)生和其他腫瘤的發(fā)生相同，其過(guò)程是非常復(fù)雜的，涉及許多遺傳和表觀遺傳改變，而目前發(fā)現(xiàn)的lncRNAs如何發(fā)揮其作用仍有較多的研究空白需要填補(bǔ)。

SChLAP1位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，在前列腺癌呈現(xiàn)出高表達(dá)[1，3]，其高效聯(lián)系著前列腺癌的預(yù)后[1，4，5]，高表達(dá)SChLAP1更容易發(fā)展成致死性前列腺癌[5]。還可以作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素用于預(yù)測(cè)前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)，而在轉(zhuǎn)移的前列腺癌中SChLAP1表達(dá)量升高尤為明顯，從而使SChLAP1有機(jī)會(huì)成為前列腺癌理想的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)前列腺癌的預(yù)后[6]。在本研究中也證實(shí)下調(diào)SChLAP1后，抑制了SChLAP1的促癌作用，PC-3細(xì)胞的凋亡明顯增加。

盡管逐漸了解LncRNA的功能，但LncRNA的失調(diào)正在成為癌癥發(fā)展和進(jìn)展的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中普遍存在的部分。LncRNAs可以干涉多個(gè)過(guò)程，包括染色體的調(diào)整、細(xì)胞增殖控制、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控以及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸。近期的研究中，LncRNA的調(diào)控作用被歸納為三個(gè)層次：（1）表觀遺傳層面[7];（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面[8];（3）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面[9]。而目前LncRNA和miRNA的相互作用歸納為三種途徑：（1）miRNA調(diào)控LncRNA的分解。miR-217調(diào)節(jié)Ago2通路從而介導(dǎo)降解LncRNA MALAT-1[10];（2）LncRNA可以阻止miRNA與靶mRNA的結(jié)合。LncRNA MALAT-1具有與miR-1堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列，發(fā)揮其海綿吸附作用，從而抑制miR-1 的作用[11];（3）LncRNA還可以加工產(chǎn)生miRNAs，從而發(fā)揮其作用。研究發(fā)現(xiàn)H19可降解生成miR-675，發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用[12]。另外，一些LncRNA與雄激素受體信號(hào)傳導(dǎo)的再激活和前列腺癌細(xì)胞代謝重要相關(guān)，可以在各個(gè)階段差異表達(dá)從而影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

考慮到LncRNA在前列腺癌中的動(dòng)態(tài)作用，LncRNA也可以作為治療靶點(diǎn)，有助于防止去勢(shì)抵抗的發(fā)展，維持穩(wěn)定的疾病并且阻止轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。在本研究中發(fā)現(xiàn)miR-101可作為SChLAP1的靶基因。在既往的研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在多種腫瘤中與轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-17]。此外，也有研究確定了miR-101還具有調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡[16，18，19]和調(diào)節(jié)自噬的作用[18，20-22]。而miR-101的上游操縱基因及為何在前列腺癌中會(huì)表現(xiàn)出明顯的低表達(dá)均缺少相關(guān)的報(bào)道，本研究給出了新的發(fā)現(xiàn)和思路。在前列腺癌細(xì)胞中SChLAP1發(fā)揮其促癌的作用，而這個(gè)作用的發(fā)揮，很可能通過(guò)其互補(bǔ)結(jié)合miR-101-5p，從而發(fā)揮抑制凋亡的作用。

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（收稿日期：2018-12-27）