曹華亮 曾建國 董新榮 謝紅旗

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸藥湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙410128；

3.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南瀏陽410331；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128）

我國植物提取物是從中藥產(chǎn)業(yè)分化出來的新興領(lǐng)域，由于其指標(biāo)成分往往能在作用機(jī)理和現(xiàn)代藥理中找到良好對接點(diǎn)，可以作為中藥國際化的橋梁產(chǎn)品在國際市場上流通，目前已探索出以“兩個標(biāo)準(zhǔn)，三個規(guī)程”理論作為技術(shù)路線可以有效控制植物提取物生產(chǎn)過程使其標(biāo)準(zhǔn)化[1]。近年來，飼用抗生素的濫用導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性已形成業(yè)界共識[2]，博落回[Macleaya Cordata（Willd）R. Br]提取物具有調(diào)節(jié)動物腸道菌群、抗炎促生長等作用[3-4]，且使用后安全有效等特點(diǎn)引起人們的廣泛關(guān)注。目前，博落回提取物已被多個國家作為飼用促生長抗生素替代產(chǎn)品，也是我國首個天然植物源藥物飼料添加劑[5]。

目前，標(biāo)準(zhǔn)的博落回血根堿提取物是以果莢為原料，博落回果莢雖然血根堿含量較高，但資源有限[6-7]。為實現(xiàn)博落回資源綜合利用，從博落回莖葉部位也獲得含血根堿的提取物，是對血根堿的有益補(bǔ)償。隨著市場對博落回提取物的需求日益增長，開發(fā)莖葉提取血根堿的方法，符合市場增長的需求，也可以提高博落回資源利用率。本文研究了博落回莖葉的血根堿提取工藝，對酸性乙醇回流和酸水滲漉提取兩種方法進(jìn)行比較，以此獲得利用兩種方法提取博落回莖葉的最佳工藝參數(shù)以及血根堿轉(zhuǎn)移率，對后期開發(fā)利用博落回莖葉具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料為河南洛陽未開花的博落回干燥莖葉，采收時間為2018年4月～2018年5月。

1.2 主要試劑

鹽酸血根堿對照品(≥98%，批次：140708)由湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司提供；水為蒸餾水；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

YB-1500A 型高速多功能粉碎機(jī)(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；PL203 電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；DK-98-IIA 電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測方法參照《農(nóng)業(yè)部1597號公告》[8]。具體色譜條件為：Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量5 μl，體積流量0.8 ml/min，檢測波長270 nm，柱溫35 ℃，流動相乙腈A-0.2%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5）B，梯度洗脫（0～14 min，25% A；14～27 min，25%～60% A；27～35 min，60%～90% A；35～37 min，60%～25% A；37～43 min，25%～25% A）。

1.4.2 對照品溶液配制

精密稱取16.12 mg 鹽酸血根堿標(biāo)準(zhǔn)品，加入MeOH∶1% HCl=1∶1 溶液(v/v，C 液)完全溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 ml 容量瓶中，以C 液定容，得到322.4 mg/l標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。吸取適量連續(xù)稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為322.4、161.2、80.60、40.30、20.15、10.08 mg/l 的對照品溶液。

1.4.3 酸性乙醇回流提取

取博落回干燥莖葉粉碎過16 目篩。稱取適量置于圓底燒瓶中，加入適量含硫酸的乙醇水溶液，適度溫度下水浴回流提取一定時間，抽濾得濾液，回收溶劑得浸膏，記錄浸膏質(zhì)量。將浸膏用C液完全溶解并定容至250 ml，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，按“1.4.1”項色譜條件下進(jìn)行檢測，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程得到提取液中血根堿的質(zhì)量濃度。

1.4.3.1 單因素考察

取原料5.0 g，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0、20%、40%、60%、80%、90%)、液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 ml/g)、硫酸濃度(0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)、提取時間(1、2、3、4、5 h)對血根堿的轉(zhuǎn)移率的影響。

1.4.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素考察酸性乙醇回流提取血根堿的結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液固比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)為自變量，以血根堿轉(zhuǎn)移率(Y)為因變量，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken 試驗設(shè)計，并利用響應(yīng)面分析法對酸性乙醇回流法提取博落回莖葉中血根堿的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 酸性乙醇回流提取響應(yīng)面試驗設(shè)計

1.4.4 酸水滲漉提取

取博落回干燥莖葉粉碎過16目篩。稱取適量置于燒杯中，加入5倍體積稀硫酸溶液浸泡一定時間后轉(zhuǎn)移至滲漉柱中，逐漸加入同濃度硫酸溶液以一定流速進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液。回收溶劑后復(fù)溶，定容至刻度，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，按“1.4.1”項色譜條件下進(jìn)行檢測，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程得到滲漉液中血根堿的質(zhì)量濃度。

1.4.4.1 單因素考察

取原料5.0 g，分別考察硫酸濃度(0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%)、滲漉溫度(20、40、60、80、90 °C)、浸泡時間(30、60、90、120、150 min)、溶劑用量(10、20、30、40、50 倍)、滲漉速度(0.5、1、1.5、2、2.5 ml/min)對血根堿的轉(zhuǎn)移率的影響。

1.4.4.2 正交試驗優(yōu)化

在單因素考察酸水滲漉提取血根堿的結(jié)果基礎(chǔ)上，以血根堿轉(zhuǎn)移率(Y)為考察指標(biāo)，選取硫酸濃度(A)、浸泡時間(B)、溶劑用量(C)、滲漉速度(D)為考察因素，采用L9(34) 正交表進(jìn)行正交試驗設(shè)計，并利用方差分析法得到酸水滲漉法提取博落回莖葉中血根堿的最佳工藝條件。試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 酸水滲漉提取正交試驗設(shè)計

1.5 指標(biāo)計算公式

血根堿轉(zhuǎn)移率(Y)按公式進(jìn)行計算：

式中：C1——提取液中血根堿的濃度(mg/l)；

C2——原料中血根堿的含量(mg/g)；

V——提取液體積(ml)；

M——博落回莖葉質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血根堿的分析

血根堿對照品在“1.4.1”項色譜條件下檢測，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，血根堿質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），其回歸方程：Y=18 518X-34.223 (n=6，R2=0.999 9)。結(jié)果表明血根堿溶液在10.08～322.4 mg/l 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 SAN標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酸性乙醇回流提取

2.2.1 單因素條件（見圖2）

圖2 酸性乙醇回流提取

乙醇體積分?jǐn)?shù)對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，血根堿轉(zhuǎn)移率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈持續(xù)上升趨勢。因此，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。液固比對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，血根堿轉(zhuǎn)移率一開始隨著液固比的增大而迅速上升，當(dāng)液固比到達(dá)25∶1 ml/g之后變?yōu)槠骄彙Ｑ鶋A在液固比為25∶1 ml/g 時的轉(zhuǎn)移率已達(dá)到了液固比30∶1 ml/g 時的95.3%。因此，固定液固比為25∶1 ml/g。硫酸濃度對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，不加硫酸時對血根堿的提取效果不理想，血根堿轉(zhuǎn)移率隨著硫酸濃度的增加而上升，在硫酸濃度為0.12%時達(dá)到最大，說明硫酸根離子與血根堿結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，固定硫酸濃度為0.12%。提取溫度對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，血根堿轉(zhuǎn)移率一開始隨著水浴溫度的增加而上升，達(dá)到70 ℃后呈緩慢上升趨勢。水浴溫度增加到80 ℃以后血根堿轉(zhuǎn)移率不再隨溫度的增加而上升。血根堿在水浴溫度為70 ℃時的轉(zhuǎn)移率達(dá)到了水浴溫度為80 ℃的96.3%。因此，固定提取溫度為70 ℃。提取時間對回流提取博落回莖葉中血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，提取時間較短時，血根堿未被提取完全，血根堿的轉(zhuǎn)移率不高。提取時間超過2 h 后，轉(zhuǎn)移率增加趨勢變緩，血根堿在提取時間為2 h 時的轉(zhuǎn)移率以達(dá)到了提取時間為5 h的95.5%。因此，固定提取時間為2 h。

2.2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.2.1 設(shè)計結(jié)果

利用軟件Design-Expert 8.0.6 Trial 進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計，對乙醇回流提取法進(jìn)行工藝優(yōu)化。試驗結(jié)果見表3。

表3 酸性乙醇回流提取響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到血根堿轉(zhuǎn)移率與各因素變量的二次方程模型為Y=82.14+2.31A+2.17B+5.3C+3.59D+1.43AB+2.25AC-0.25AD+1.62BC+0.33BD-3.52CD-1.25A2-2.51B2-2.87C2-1.3D2。

2.2.2.2 方差分析

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表4。

從表4 可知，回歸模型F 值為9.29，概率P＜0.000 1，表明模型極顯著；而失擬項不顯著(P=0.169 4＞0.05)，表明所建模型擬合度良好，能替代試驗真實點(diǎn)解釋響應(yīng)結(jié)果；模型的變異系數(shù)(CV)為3.11%，信噪比為12.651，均在可接受范圍內(nèi)，R2=0.902 8，表明90.28%響應(yīng)值變化可以用此模型解釋，可進(jìn)行分析和預(yù)測。各因素一次項和二次C2的P 值均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，且交互項CD 和二次項B2均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，即各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是存在一定的交互作用。各因素對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響依次為C(提取溫度)＞D(提取時間)＞A(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞B(液固比)。

表4 酸性乙醇回流提取方差分析

2.2.2.3 響應(yīng)面分析

通過Box-Behnken 試驗結(jié)果得到各個因素間交互的作用對血根堿轉(zhuǎn)移率影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖3。響應(yīng)面圖坡度越陡峭，等高線圖越接近橢圓，則表明該因素對響應(yīng)值得影響越顯著，反之則表明該因素對響應(yīng)值的影響不顯著。

圖3 各因素響應(yīng)面圖

由圖3(f)可知，響應(yīng)曲面開口向下，坡度陡峭，等高線呈橢圓形，說明提取溫度與提取時間對血根堿轉(zhuǎn)移率具有很強(qiáng)的交互作用，呈顯著性影響；其它曲面圖較為平緩，等高線接近圓形，說明兩因素間無明顯交互影響。響應(yīng)曲面圖與方差分析結(jié)果一致，模型可靠。

2.2.3 驗證試驗

通過回歸模型預(yù)測，得到從博落回莖葉中提取血根堿的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸濃度0.12%，提取溫度80 ℃，提取時間2.07 h。在此條件下，血根堿轉(zhuǎn)移率理論上可達(dá)90.60%?？紤]操作的實際情況，將優(yōu)化工藝條件修改確定為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸濃度0.12%，提取溫度80 ℃，提取時間2 h。按上述修正后的提取條件進(jìn)行莖葉提取，血根堿平均轉(zhuǎn)移率為(89.36±0.49)%(n=5，R2=0.54%)，與預(yù)測值90.60%相吻合，提取效果理想。

再將提取液回收溶劑至無醇味，加入10 倍水溶解完全后過濾，濾液用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 值至9 使血根堿完全沉淀，離心得沉淀，干燥后得到博落回莖葉提取物，最終收率為(24.27±0.92)%(n=5，R2=3.77%)，提取物中血根堿的含量為(1.65±0.06)%(n=5，R2=3.36%)。

2.3 酸水滲漉提取

2.3.1 單因素條件

硫酸濃度對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4(A)。血根堿轉(zhuǎn)移率隨著硫酸濃度的增加一開始迅速提高之后變?yōu)槠骄?，?dāng)硫酸濃度為1%時血根堿轉(zhuǎn)移率為最高值的98.8%。因此，硫酸濃度為1%。滲漉溫度對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4(B)。溫度對滲漉法提取博落回莖葉血根堿的影響較大，血根堿的轉(zhuǎn)移率隨著溫度的增加而提高，當(dāng)溫度達(dá)到80 °C后，血根堿轉(zhuǎn)移率上升不明顯。因此，固定滲漉溫度為80 ℃。浸泡時間對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4(C)。浸泡時間對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響不明顯。因此，固定浸泡時間為30 min。溶劑用量對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4(D)。溶劑用量為30 倍后血根堿轉(zhuǎn)移率上升趨勢較為平緩，已達(dá)到最高值的90.5%。因此，固定溶劑用量為30 倍。滲漉速度對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4(E)。血根堿轉(zhuǎn)移率隨著滲漉速度的加快呈下降趨勢，表明滲漉速度越快提取效果越不理想。因此，固定滲漉速度為0.5 ml/min。

2.3.2 正交試驗

采用L9(34) 正交表對滲漉法提取博落回莖葉中血根堿的提取工藝進(jìn)行正交試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表5。并利用軟件SPSS 23.0 對表5 進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

正交試驗極差R 的大小與該因素對血根堿轉(zhuǎn)移率的大小成正比。由表5可知，正交試驗極差(R)分析可得滲漉提取法對血根堿轉(zhuǎn)移率的影響大小為：C(溶劑用量)＞D(滲漉速度)＞A(硫酸濃度)＞B(浸泡時間)，由表6可知因素C對滲漉法提取博落回莖葉中血根堿轉(zhuǎn)移率影響具有極顯著作用，因素D 具有顯著作用，其他因素對其影響不顯著。極差R 值相對較小的因素A、B，再結(jié)合單因素考察滲漉提取條件，綜合考慮時間、經(jīng)濟(jì)成本等實際生產(chǎn)條件，確定最佳滲漉提取工藝為：A2B1C3D1，即以1%硫酸為滲漉液，浸泡時間30 min，溶劑用量30倍，滲漉速度0.5 ml/min。

圖4 酸水滲漉提取各條件對博落回莖葉血根堿轉(zhuǎn)移率的影響

2.3.3 驗證試驗

在正交試驗結(jié)果得到的最佳滲漉提取工藝條件下進(jìn)行穩(wěn)定性驗證試驗，重復(fù)5次。得到血根堿平均轉(zhuǎn)移率為(83.63±2.09)%(n=5，R2=2.49%)。表明提取工藝條件合理，穩(wěn)定可行。

再將酸水滲漉提取得到的滲漉液加Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 值至9 使血根堿完全沉淀下來，離心得沉淀，干燥后得到博落回莖葉提取物，最終收率為(21.64±0.78)%(n=5，R2=3.61%)，提取物中血根堿的含量為(2.25±0.11)%(n=5，R2=4.88%)。

表5 滲漉提取正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表6 滲漉提取方差分析

3 結(jié)論

博落回提取物具有調(diào)節(jié)動物腸道菌群、促生長等作用[6]，被多個國家作為飼用飼料添加劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)，在替代飼用促生長抗生素方面效果顯著[9]。目前，有關(guān)博落回血根堿的提取研究報道及工業(yè)生產(chǎn)均以博落回果莢為原料[10]，存在資源蘊(yùn)藏量少等問題。由此可見，開發(fā)博落回血根堿提取物的原料資源以及提取新工藝，以滿足市場對博落回提取物日益增長的需求是十分必要的。

本文分別使用乙醇回流及酸水滲漉法對博落回莖葉血根堿提取工藝進(jìn)行研究，通過單因素試驗確定各個因素水平范圍，再分別對工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇回流試驗結(jié)果：乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸濃度為0.12%，提取溫度為80 ℃，提取時間為2 h。該條件下血根堿轉(zhuǎn)移率為89.36%。正交試驗優(yōu)化酸水滲漉試驗結(jié)合單因素試驗結(jié)果：硫酸濃度為1%，浸泡時間為30 min，滲漉溫度為80 ℃，溶劑用量為30倍，滲漉速度為0.5 ml/min。該條件下血根堿轉(zhuǎn)移率為83.63%。通過兩種方法用于提取博落回莖葉中血根堿轉(zhuǎn)移率的結(jié)果可以看出差異并不大。但在后續(xù)堿沉?xí)r酸水滲漉法比酸性乙醇回流法操作簡便，最終提取物中血根堿的含量可達(dá)(2.25±0.11)%(n=5，R2=4.88%)。兩種提取方法溶劑用量一致，水相對于乙醇的價格較低，具有不易揮發(fā)等特點(diǎn)。工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)結(jié)合實際情況進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，為博落回莖葉綜合利用提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。