高雙喜 王 萱 任 菁 李 妍 周國(guó)璽 郝慶紅 李 玘 郭云霞*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.張家口市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北張家口075000）

由于草場(chǎng)退化、國(guó)家禁牧政策的實(shí)施，養(yǎng)羊方式由放牧轉(zhuǎn)向舍飼養(yǎng)殖，使養(yǎng)羊成本大幅度提升，其中飼料成本占養(yǎng)殖成本的80%，而粗飼料占比為全混和日糧的40%，保證綿羊最佳的生長(zhǎng)性能[1]。因此，如何降低粗飼料成本，提高養(yǎng)殖效益，是解決目前飼料成本高的關(guān)鍵。發(fā)展微貯飼料提高粗飼料品質(zhì)，可在一定程度上緩解我國(guó)飼料供應(yīng)短缺問(wèn)題，同時(shí)解決冬季干草養(yǎng)分不足、適口性差等。我國(guó)秸稈儲(chǔ)備豐富，每年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈近7億噸，主要由多聚葡萄糖（纖維素、半纖維素）和木質(zhì)素組成。由于纖維素是由β-1，4糖苷鍵連接多個(gè)β-D-吡喃葡萄糖環(huán)而形成的線性、不溶于水的高分子聚合物，在自然情況下很難降解[2]。酶解法具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染、能耗少等優(yōu)點(diǎn)[3]，當(dāng)飼喂飼用纖維素酶后可顯著提高湖羊瘤胃菌群的多樣性和豐度，影響瘤胃菌群結(jié)構(gòu)[4]，但目前酶法水解普遍成本高、酶解周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。因此高效纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選具有重要意義。

反芻動(dòng)物擁有大容積的瘤胃，其內(nèi)含有豐富的細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)等微生物，是粗飼料消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用的主要場(chǎng)所，飼料會(huì)影響瘤胃的發(fā)酵模式，進(jìn)而影響瘤胃微生物區(qū)系[5]。本著同源性原則，由羊瘤胃液中分離篩選可降解纖維素的芽孢菌株，以期為青貯菌劑的開(kāi)發(fā)，提升粗飼料品質(zhì)，降低飼料成本及其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用提供工業(yè)化菌株。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

2017 年4 月，從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)基地，采集健康黑頭杜泊羊的瘤胃液，四層紗布過(guò)濾，裝入三角瓶中，冷藏備用。

1.2 培養(yǎng)基及主要溶液

種子培養(yǎng)基：氯化鈉5 g/l，牛肉膏5 g/l，蛋白胨10 g/l。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g/l，(NH4)2SO42 g/l，氯化鈉0.5 g/l，磷酸氫二鉀1 g/l，7 水合硫酸鎂0.5 g/l，剛果紅0.4 g/l，瓊脂12 g/l，pH值自然。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g/l，(NH4)2SO42 g/l，氯化鈉0.5 g/l，磷酸氫二鉀1 g/l，7 水合硫酸鎂0.5 g/l，剛果紅0.4 g/l，瓊脂12 g/l，pH值自然。

濾紙條崩解培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.0 g/l，7水合硫酸鎂0.5 g/l，磷酸二氫鉀1.0 g/l，酵母膏0.1 g/l，濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶，pH值自然。

西蒙氏枸櫞酸鹽、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、明膠、接觸酶、淀粉水解等生理生化鑒定用培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 芽孢桿菌初篩

從健康羊瘤胃中取1 ml 瘤胃液于100 ml 容量瓶中，用無(wú)菌水定容制成菌懸液，80 ℃水浴10 min，室溫取上清液1 ml于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h后，取1 ml發(fā)酵液于9 ml無(wú)菌水的試管中，進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液200 μl涂布到纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。分別挑取不同形態(tài)的菌落在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上劃線接種，并做好標(biāo)記，4 ℃保存。

將篩選出的不同形態(tài)的單菌落分別于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上進(jìn)行打孔，打孔直徑為0.65 cm，37 ℃恒溫培養(yǎng)觀察產(chǎn)生透明圈的大小，并用直尺進(jìn)行測(cè)量。選出菌圈直徑較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 芽孢桿菌復(fù)篩

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將葡萄糖烘干至恒重后配制成1 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。將4 ml 離心管分別標(biāo)號(hào)為0～6，按表1 順序加入相應(yīng)試劑，并混勻，各管混合物沸水浴10 min，待冷卻至室溫，各吸取200 μl至96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀490 nm進(jìn)行測(cè)定，并平行操作。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 纖維素酶（CMC）酶活測(cè)定

將纖維素酶酶活較高的菌株分別接種于纖維素種子培養(yǎng)液中，37 ℃搖床，180 r/min培養(yǎng)12 h，以2 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)18 h，得發(fā)酵液。

取3 支帶有50 ml 刻度的試管，1 支管作空白對(duì)照，2 支管作平行樣品管。取4 ml 發(fā)酵培養(yǎng)液于4 個(gè)1.5 ml EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，分別取上清混勻后作為粗酶液，加熱煮沸后的粗酶液為空白對(duì)照。以4 ml 0.5%（w/v）的CMC-Na 溶液（pH值5.0）作為反應(yīng)底物。體系按照表2反應(yīng)完后沸水浴5 min。

表2 纖維素酶反應(yīng)體系

反應(yīng)完的體系用蒸餾水定容至40 ml，取出200 μl加至96孔酶標(biāo)板上，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下的吸光度。

酶活單位定義為：在pH值5.0和50 ℃的反應(yīng)條件下，1 min 1 ml粗酶液催化CMC-Na產(chǎn)成1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U/l）。

X=(A×v×1 000)/(M×V×T)

式中：X——鈍頂螺旋藻對(duì)（U/ml）；

A——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的葡萄糖含量(mg/ml)；

v——反應(yīng)液總體積（ml）；

M——葡萄糖摩爾質(zhì)量（180.2 g/mol）；

V——反應(yīng)中加入的粗酶液體積（ml）；

T——反應(yīng)時(shí)間（min）。

2.2.3 濾紙?zhí)腔福‵PA）的測(cè)定

取3 支帶有50 ml 刻度的試管，1 支作空白對(duì)照，2 支作平行樣品管。取4 ml 發(fā)酵20 h 培養(yǎng)液平均分裝于4 個(gè)1.5 ml EP 管中。然后12 000 r/min，4 ℃離心15 min。分別取上清混勻后的粗酶液，加熱煮沸后的粗酶液為空白對(duì)照。將濾紙剪成規(guī)格為1.0 cm×6.0 cm的長(zhǎng)條，放入試管中，置于50 ℃水浴鍋中預(yù)熱2 min。以4 ml 緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)。體系按照表3 反應(yīng)完后沸水浴5 min。其余同CMC酶活測(cè)定方法。

表3 濾紙酶反應(yīng)體系

2.3 濾紙條崩解試驗(yàn)

將菌圈直徑較大的菌株制成菌懸液，取1 ml置于裝有50 ml 濾紙條崩解培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 震蕩培養(yǎng)，每隔12 h定期觀察濾紙條崩解情況。

2.4 菌株的生理生化鑒定

用平板劃線獲得H-7的單菌落，觀察并記錄菌落形態(tài)學(xué)特征。菌體染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。針對(duì)菌屬參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)目的菌株進(jìn)行生理生化特征試驗(yàn)。

2.5 16S rDNA序列分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株的發(fā)酵液（培養(yǎng)12 h）1 000 μl至EP管中，5 000 r/min離心5 min，棄上清，無(wú)菌水洗滌沉淀，重復(fù)兩次。用400 μl TE重懸菌體，加入20 μl溶菌酶37 ℃過(guò)夜；加入400 μl CTAB 提取液，輕輕搖勻，65 ℃水浴40 min（每10 min 輕搖一次）；冷卻至室溫，加400 μl 酚-氯仿（1∶1），輕輕搖勻，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；吸取上清液，加入400 μl氯仿，輕輕搖勻，4 ℃12 000 r/min 離心10 min；吸取上清液，加入等體積冰凍異丙醇，輕輕搖勻，-20 ℃靜置30 min，沉淀DNA，4 ℃12 000 r/min 離心20 min，棄水相，75%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干；200 μl TE溶解沉淀，加入20 μl RNA 酶（20 mg/ml）37 ℃保溫30 min 以等體積的酚-氯仿和氯仿各抽提一次；吸取上清液，加入10-1體積3 mol/l NaAc 和兩倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕搖勻至出現(xiàn)絮狀沉淀試驗(yàn)，1 000 r/min 離心30 min；棄上清，用75 %乙醇洗滌DNA沉淀2次，風(fēng)干。作為制作PCR 體系的模板。無(wú)菌條件下配置25 μl PCR體系，混勻。

PCR體系：mix 12.5 μl，27 F 0.5 μl，1492 0.5 μl，ddH2O 11 μl，模板0.5 μl。

PCR 程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1.5 min，32個(gè)循環(huán)后，4 ℃保存。

產(chǎn)物于-20 ℃保藏。送華大基因測(cè)序，利用標(biāo)準(zhǔn)菌與得到的序列在EzTaxon server 2.1 的網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株種屬。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌株的初篩

將分離純化后得到的芽孢細(xì)菌，接種于打孔的纖維素剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，篩選得到透明圈直徑較大的9 株細(xì)菌，其中H-7 透明圈最大。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

表4 初篩打孔透明圈直徑結(jié)果

圖2 H-7剛果紅平板試驗(yàn)

3.2 菌株酶活測(cè)定

通過(guò)纖維素酶和濾紙酶酶活測(cè)定，其中E-12 與H-7 兩株菌的纖維素酶酶活相對(duì)較高，分別為：0.17 U/ml與0.18 U/ml。濾紙酶酶活相對(duì)較高為E-12和H-7菌株。

表5 纖維素酶酶活與濾紙酶酶活

3.3 濾紙條崩解試驗(yàn)

將酶活較高的4 株菌株18 h 的發(fā)酵液，按2%接種量接種于含有濾紙條的液體培養(yǎng)基中，每隔12 h觀察濾紙條崩解情況，結(jié)果見(jiàn)表6。崩解試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3 和圖4。結(jié)果顯示H-7 的崩解效果最好。綜合考慮剛果紅羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中菌落透明圈直徑，酶活和濾紙條崩解結(jié)果，對(duì)菌株H-7 進(jìn)行后續(xù)鑒定。

表6 濾紙條崩解試驗(yàn)結(jié)果

圖3 濾紙條崩解初始

3.4 菌株鑒定

3.4.1 菌株的形態(tài)特征及生理生化特征

菌株H-7的菌落較大且呈現(xiàn)出不透明的乳白色，邊緣不規(guī)則，且菌落表面粗糙，存在皺褶，如圖5。芽孢形態(tài)為桿狀芽孢。H-7 生理生化特征研究結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧，具體特征如表7所示。

圖4 濾紙條完全崩解

3.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將克隆得到的纖維素降解菌株H-7的16S r DNA序列經(jīng)測(cè)序，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 搜索和與標(biāo)準(zhǔn)芽孢桿菌屬（Bacillus）的基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示，一致性均大于97%（見(jiàn)表8）。因此，判定該菌株為芽孢桿菌屬。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖6）。

圖5 菌落形態(tài)

表7 H-7菌株生理生化試驗(yàn)

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，在以上12 個(gè)菌株中，菌株H-7 與Bacillus siamensis（AJVF01000043）菌株同源性達(dá)99 %以上，因此初步斷定H-7 為暹羅芽孢桿菌。

表8 H-7與標(biāo)準(zhǔn)菌相似度

圖6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4 討論

自然界中產(chǎn)纖維素酶微生物種類很廣，包括真菌、細(xì)菌和放線菌。一般真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶活比細(xì)菌高，但細(xì)菌具有發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間短、產(chǎn)纖維素酶使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。芽孢桿菌具有促進(jìn)腸道分泌消化酶，提高機(jī)體消化吸收能力及增強(qiáng)免疫力作用[6-7]。研究報(bào)道，在瘤胃中發(fā)現(xiàn)，蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌[8]及短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌[9]均可產(chǎn)纖維素酶，但是酶活報(bào)道不一，且主要以纖維素酶（CMC）的活性為指標(biāo)，如郭愛(ài)蓮等[10]從牛瘤胃及其糞便中分離到了兼性厭氧芽孢桿菌，其中CMC 酶活達(dá)到了780 U/ml。牛明芬等[11]從牛糞中分離得到了地衣芽孢桿菌，CMC 酶活達(dá)到了1.031 U/ml。酶活力的不同與菌株的種屬及纖維素酶的組成有關(guān)。纖維素酶是多組分酶，包括葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶等。CMC 從纖維素的非還原多聚體末端，隨機(jī)水解β-1,4糖苷鍵，每次切下1個(gè)纖維二糖分子，將天然纖維素分解為直鏈纖維素，產(chǎn)生大量的還原性末端。FPA則代表纖維素酶組分的總活力，反映了3類酶組分的協(xié)同作用[12]。本研究以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基上篩選出1株產(chǎn)纖維素酶酶活和濾紙酶酶活較高的芽孢細(xì)菌Bacillus siamensis H-7，在篩選培養(yǎng)基中CMC 酶活達(dá)到0.18 U/ml，F(xiàn)PA酶活達(dá)到0.44 U/ml。對(duì)于暹羅芽孢桿菌的研究報(bào)道較多，主要在抗菌活性[13]、產(chǎn)纖溶酶[14]、產(chǎn)蛋白酶[15]等起作用。本試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）具有產(chǎn)纖維素酶的活性，為該菌的進(jìn)一步應(yīng)用提供了廣泛的空間。

本研究從黑頭杜泊羊瘤胃中首次篩選到暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）H-7，并證實(shí)其有較高的纖維素酶酶活，研究結(jié)果補(bǔ)充了暹羅芽孢桿菌的生物學(xué)功能。另外，試驗(yàn)所用菌株來(lái)源于羊瘤胃，對(duì)飼料的后續(xù)飼喂提供了安全保障，以期能夠更好地利用秸稈產(chǎn)生高品質(zhì)飼料。

纖維素是自然界中含量最為豐富的碳水化合物，是一類十分重要的可再生資源，但由于其不易被降解，利用率低，造成了極嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題。當(dāng)前，人們利用自然界中能夠分泌纖維素降解酶的微生物有效破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，以期有效開(kāi)發(fā)與利用纖維素資源。目前已應(yīng)用于多領(lǐng)域，例如將其作為能源、食品和化工產(chǎn)業(yè)的原料，生產(chǎn)乙醇、乳酸和單細(xì)胞蛋白等；用于地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤肥力的調(diào)節(jié)以及自然生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)與強(qiáng)化；堆肥過(guò)程中利用微生物提高纖維素和半纖維素的降解率、縮短發(fā)酵周期、提高腐熟和堆肥質(zhì)量；養(yǎng)殖行業(yè)中，降解秸稈來(lái)提高秸稈等粗飼料的利用率。雖然利用微生物降解纖維素提高了資源的利用率，但目前市售菌株存在產(chǎn)酶活性不穩(wěn)定，單一菌株降解率低，低溫環(huán)境降解效果差等問(wèn)題。因此，今后應(yīng)多致力于產(chǎn)纖維素酶低溫菌株、復(fù)合纖維素降解菌的開(kāi)發(fā)與利用等，以期能在低溫自然環(huán)境中降低生產(chǎn)成本、更加節(jié)約資源，提高秸稈等粗飼料的利用率，增加養(yǎng)殖效益。