孫學(xué)亮 楊樹元 畢相東 劉 波 陳成勛 郭永軍*

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384；

2.天津市西青區(qū)楊柳青鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，天津300380）

“中科3號”異育銀鯽，為中國科學(xué)院水生生物研究所篩選培育的異育銀鯽第三代新品種，其特點是生長快，水溫適應(yīng)范圍廣，對水體pH值、鹽度、低溶解氧等理化因子有較強的耐受力[1]，是一種肉質(zhì)鮮美、魚肉品質(zhì)和營養(yǎng)價值較高，營養(yǎng)成分易被人體吸收的低脂肪和高蛋白的優(yōu)質(zhì)魚類。

螺旋藻廣泛分布于世界各地的海水、咸淡水和淡水中[2]，繁殖速度快且條件簡單，可進行大量的人工繁殖，其市場經(jīng)濟價值很高。目前國內(nèi)外大規(guī)模人工培育的螺旋藻主要有鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻和印度螺旋藻[3]，其中，鈍頂螺旋藻被廣泛應(yīng)用于魚、蝦、蟹、貝等水產(chǎn)動物的餌料或作為飼料添加劑[4-5]。它具有高蛋白質(zhì)、高營養(yǎng)，增強和調(diào)節(jié)機體免疫力等特性，并且含有較多的維生素和微量元素[6-7]。由于螺旋藻藻體微小，加之細胞壁結(jié)構(gòu)主要是蛋白質(zhì)，纖維素含量少，極易被水生動物消化吸收，消化率達75%[8]，可直接作為動物和魚類的開口和幼苗餌料[9]。

本試驗通過在飼料中添加鈍頂螺旋藻，研究其對異育銀鯽生長、抗氧化、非特異性免疫指標的影響，以期為鈍頂螺旋藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚購自天津市恒興富民水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，初始體重為(102.08±0.38) g。

鈍頂螺旋藻粉購自天津市晨輝飼料有限公司。異育銀鯽基礎(chǔ)飼料購自山東市海博農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 試驗方法

試驗開始前使用基礎(chǔ)飼料馴化7 d。在基礎(chǔ)飼料中添加0%、0.8%、1.6%、3.2%的鈍頂螺旋藻。試驗為期60 d。每個水平設(shè)兩個重復(fù)，每箱32尾，試驗開始前對試驗魚進行體重的測量。連續(xù)喂食60 d后取樣，測定生長指標、血漿生理指標、非特異性免疫指標等。基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)≥28%、粗纖維≤10%、粗脂肪≥3%、粗灰分≤15%、水分≤14%。

1.3 試驗管理

試驗地點為天津農(nóng)學(xué)院水循環(huán)養(yǎng)殖實驗室，在水族箱中進行喂養(yǎng)。每天分三次投喂，時間分別為8：00、13：00和18：00，投喂量占魚體重量的1%左右。投喂半小時后清理殘餌和糞便，每天換水一次，換水量20%。

1.4 樣品采集

喂食60 d后，將試驗魚饑餓24 h后稱重取樣，每箱隨機取9 尾魚，測量體長、體重等。使用注射器尾靜脈取血，裝入2 ml的離心管，加入少量肝素鈉，然后3 000 r/min（冷凍離心機）離心10 min，取上清液裝入另外的試管中，-80 ℃冷凍保存，用于血漿指標測定。取肝胰臟，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標

1.5.1 生長指標

存活率（SR，%）=100×Nt/N0

增重率（WGR，%）=(Wt-W0)×100/W0

蛋白質(zhì)效率（PER，%）=(Wt-W0)×100/(F×P)

特定生長率(SGR，%/d)=[ln(Wt)-ln(W0)]×100/t

飼料系數(shù)（FCR）=F/(Wt-W0)

肝體比（HSI，%）=100×Wg/Wt

肥滿度(CF，g/cm3)=Wt/lt3

式中：t——試驗天數(shù)（d）；

Nt——終末存活尾數(shù)；

N0——初始放養(yǎng)尾數(shù)；

W0——平均初始體重（g）；

Wt——平均最終體重（g）；

F——飼料攝取量干重（g）；

P——飼料蛋白質(zhì)含量（%）；

Wg——肝胰臟質(zhì)量（g）；

Lt——平均終末魚體長（cm）。

1.5.2 生理指標

使用全自動血細胞分析儀對實驗魚全血進行如紅細胞、白細胞、中間細胞等的細胞數(shù)量和細胞比率的測定，以及血紅蛋白含量和紅細胞壓積比率等的測定分析。

1.5.3 生化指標

蛋白酶活力的測定

制作蛋白酶活力標準曲線：將已配制好的不同濃度酶標準溶液加入試劑做顯色處理，在680 nm波長下比色，測定光密度。以光密度讀數(shù)為縱坐標（Y），酪氨酸克數(shù)為橫坐標（X），繪制曲線。蛋白酶活力標準曲線方程：

Y=0.001 8X+0.002 2，R2=0.998 5

分別準備測定管和對照管，測定管添加不同組的5%腸道上清液，每組三個平行；對照管加入去離子水。按照實驗操作依次加入配制好的試劑，37 ℃水浴，離心，顯色。在680 nm 波長下比色，以對照管校零，讀取測定管光密度進行記錄。

總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準差”表示，用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，先將數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，差異顯著(P＜0.05)的用Duncan's法做多重比較。

2 結(jié)果

2.1 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽的生長指標的影響（見表1）

表1 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽生長指標的影響

由表1 可知，最終體重、增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率隨添加量的增加呈上升趨勢，其中1.6%、3.2%組最終體重、增重率、特定生長率（SGR）顯著高于0%、0.8%組，且1.6%、3.2%組之間無顯著差異（P＞0.05)；在蛋白質(zhì)效率（PER）方面，1.6%、3.2%組顯著高于0%組（P＜0.05），0.8%組與0%組無顯著差異（P＞0.05)；在飼料系數(shù)（FCR）方面，各試驗組隨添加量的增加呈下降趨勢，但試驗組間無顯著差異（P＞0.05)；肥滿度(CF)和肝體比（HSI)方面各試驗組間無顯著差異（P＞0.05)。

2.2 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿生理指標的影響（見表2）

表2 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽的血漿生理指標的影響

由表2可見，添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血紅蛋白、紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)、中間細胞總數(shù)、淋巴細胞總數(shù)、淋巴細胞比率、中間細胞比率、中性粒細胞比率、紅細胞壓積生理指標均無顯著差異（P＞0.05)。

2.3 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟抗氧化的影響

2.3.1 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟總超氧化物歧化酶活力的影響（見表3）

表3 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影響

由表3 可知，隨著鈍頂螺旋藻添加量的增大，血漿中T-SOD 酶活力呈逐漸上升的趨勢，3.2%添加組達最大值，且顯著高于0%、0.8%、1.6%添加組（P＜0.05）。肝胰臟T-SOD 酶活力0.8%、1.6%、3.2%添加組顯著高于0%添加組（P＜0.05），且組間無顯著差異（P＞0.05)。

2.3.2 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟過氧化氫酶活力的影響（見表4）

如表4 可知，隨著鈍頂螺旋藻添加量的增大，血漿中CAT酶活力呈逐漸上升的趨勢，3.2%添加組顯著高于0%、0.8%、1.6%添加組（P＜0.05）。各試驗組肝胰臟CAT 酶活力均顯著高于0%添加組（P＜0.05），且組間無顯著差異。

表4 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟過氧化氫酶（CAT）活力的影響

2.3.3 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟丙二醛(MDA)含量的影響（見表5）

表5 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟丙二醛（MDA）含量的影響

如表5 可知，3.2%添加組血漿中MDA 含量顯著低于其他組（P＜0.05）,其他添加組間差異不顯著（P＞0.05）；肝胰臟丙二醛（MDA）含量各組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.4 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟總抗氧化能力的影響（見表6）

如表6 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加組血漿、肝胰臟總抗氧化能力與0%添加組無顯著差異（P＞0.05）。

表6 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟總抗氧化能力（T-AOC）的影響

2.3.5 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響（見表7）

表7 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力的影響

如表7 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加組血漿、肝胰臟GSH-Px活力與0%添加組無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽非特異性免疫的影響

2.4.1 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟堿性磷酸酶活力的影響（見表8）

表8 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟堿性磷酸酶（AKP）活力的影響

如表8可知，0.8%、1.6%添加組血漿、肝胰臟AKP活力與0%添加組無顯著差異（P＞0.05）；3.2%添加組顯著高于0%添加組（P＜0.05）。

2.4.2 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟酸性磷酸酶活力的影響（見表9）

表9 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟酸性磷酸酶（ACP）活力的影響

如表9 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加組血漿、肝胰臟ACP活力與0%添加組無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽肝功能的影響（見表10）

表10 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的影響(卡門氏單位)

如表10可知，1.6%、3.2%添加組血漿GOT活力顯著低于0%添加組（P＜0.05）；0.8%添加組顯著高于0%添加組（P＜0.05）。1.6%、3.2%添加組GPT活力顯著低于0%添加組（P＜0.05）；0.8%添加組顯著高于0%添加組（P＜0.05）。

2.6 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽腸道消化酶活力影響(見表11)

表11 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽腸道消化酶活力的影響(U/mg prot.)

由表11可知，蛋白酶活力隨著添加量的增加，呈上升趨勢，其中0%、0.8%組分別與1.6%、3.2%組產(chǎn)生顯著差異（P＜0.05)，0%、0.8%組之間差異不顯著（P＞0.05)，1.6%組顯著低于3.2%組（P＜0.05)；淀粉酶活性0%、0.8%、1.6%、3.2%四組之間差異不顯著（P＞0.05)；脂肪酶活性在0.8%組達到最高，0%、0.8%組比1.6%、3.2%組活性顯著升高（P＜0.05)，0%、0.8%組之間和1.6%、3.2%組之間差異不顯著（P＞0.05)。

3 討論

3.1 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽生長、生理指標的影響

本試驗通過對基礎(chǔ)飼料中添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽生長的影響發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加3.2%比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽的增重率（WGR）有了明顯的提升，飼料系數(shù)也有明顯降低，與0%組形成了顯著差異（P＜0.05）；在血漿生理指標如紅細胞、白細胞、中間細胞數(shù)量等沒有產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05），血紅蛋白、白細胞，紅細胞比率沒有產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05）；綜上所述，在基礎(chǔ)飼料中添加3.2%比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽的生長有顯著增長。本試驗中四組試驗魚的紅細胞、白細胞等數(shù)量和比率沒有產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05），血紅蛋白也沒有顯著差異（P＞0.05）。

國內(nèi)目前對螺旋藻在飼料的添加應(yīng)用進行了比較多的研究。呂子君[10]通過試驗表明鈍頂螺旋藻對海南長臀鮠的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）等有顯著提高（P＜0.05），餌料系數(shù)(FCR)隨著鈍頂螺旋藻的增加顯著降低（P＜0.05）。沈子偉[11]在試驗中使用螺旋藻飼養(yǎng)鰻鱺，生長、健康狀態(tài)良好，體型、體重等指標比對照組均顯著提升（P＜0.05）。本文中隨著鈍頂螺旋藻比例的增加試驗魚體重等指標隨之升高，與前人試驗結(jié)果相同。韋公遠[12]通過對水生動物如蟹苗、扇貝等的培育表明鈍頂螺旋藻含有及其豐富的蛋白質(zhì)，且極易吸收，能夠提高蛋白質(zhì)的利用效率。本試驗中蛋白質(zhì)效率1.6%和3.2%組均比0%顯著提高（P＜0.05），與前人試驗結(jié)果相同。試驗中試驗魚可能是由于螺旋藻脂肪、糖分含量太少，致使肥滿度差異不顯著（P＞0.05）。王啟倫[4]試驗結(jié)果與推論與本試驗相同。

3.2 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟抗氧化指標的影響

總超氧化物歧化酶（T-SOD）對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，通過清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護細胞免受損傷[13]。本次試驗結(jié)果表明，添加0.8%、1.6%、3.2%的鈍頂螺旋藻能不同程度提升異育銀鯽血漿和肝胰臟中SOD活力，這說明鈍頂螺旋藻有增強SOD活力，清除異育銀鯽體內(nèi)自由基的作用。這與左紹遠[14]、曹穎莉等[15]和趙飛艷[16]報道的螺旋藻多糖對小鼠血清和肝胰臟SOD的結(jié)論相似。

過氧化氫酶（CAT）是能夠催化過氧化氫來分解成氧和水的酶，通過把SOD 反應(yīng)生成的過氧化氫產(chǎn)物進一步催化成水，從而徹底清除生物體內(nèi)的自由基[17]，減少自由基對機體的損害。與谷胱甘肽過氧化物酶共同保護巰基酶和膜蛋白，使細胞膜在過氧化作用下免受損壞[18]。本試驗中，與0%鈍頂螺旋藻添加組相比，添加0.8%、1.6%、3.2%鈍頂螺旋藻的異育銀鯽血漿及肝胰臟中的CAT活力顯著提高，這說明鈍頂螺旋藻顯著提高異育銀鯽血漿及肝胰臟的過氧化氫酶活力，增加機體的抗氧化能力，這與Thaakur S R等[19]的結(jié)論相符。

生物體消耗分解能量物質(zhì)從而大量產(chǎn)生氧自由基，機體不能及時清除，氧自由基在體內(nèi)堆積后導(dǎo)致脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，機體內(nèi)的丙二醛（MDA）含量能夠反映出機體內(nèi)脂質(zhì)物過氧化反應(yīng)的程度，同時間接地反映出細胞損傷的程度。

試驗結(jié)果顯示，3.2%鈍頂螺旋藻添加組的血漿MDA 含量比0%鈍頂螺旋藻添加組有顯著下降，表明鈍頂螺旋藻能降低脂質(zhì)過氧化物在機體內(nèi)的累積，這與曹穎莉等[15]和趙飛艷[16]的研究結(jié)果一致。

試驗結(jié)果中添加鈍頂螺旋藻組的異育銀鯽血漿及肝胰臟的總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力與添加0%鈍頂螺旋藻組相比無明顯變化，這可能與試驗周期、研究品種和鈍頂螺旋藻添加量等條件的不同有關(guān)。

3.3 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽血漿及肝胰臟非特異性免疫的影響

生物體內(nèi)的堿性磷酸酶(AKP)是一種重要的代謝調(diào)控酶，直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[20]。ACP 與溶酶體生理功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)[21]。AKP 和ACP 在蛋白酶的去磷酸化過程中起著關(guān)鍵的作用，它們是生物體內(nèi)解毒體系的重要組成部分[22]。本試驗顯示，鈍頂螺旋藻添加量為3.2%時，異育銀鯽血漿及肝胰臟的AKP活力能顯著提高，這與董學(xué)興等[23]報道螺旋藻能增強異育銀鯽的非特異性免疫機能的研究趨勢一樣。

3.4 添加不同比例鈍頂螺旋藻對異育銀鯽肝功能的影響

血清中的GOT 和GPT 活性大小是最能顯示肝細胞受損的指標，從而判定肝胰臟是否受到損傷。如果當(dāng)機體的組織中毒后產(chǎn)生了病變或是受到了損傷時，細胞生物膜的通透性會導(dǎo)致增加，此時GOT和GPT會被大量的釋放到血液中[24]，血清中的GOT和GPT活性被增強。從試驗結(jié)果來看，與添加0%鈍頂螺旋藻組相比，添加1.6%、3.2%鈍頂螺旋藻的異育銀鯽血漿中GOT和GPT的活力顯著降低，這說明鈍頂螺旋藻對肝功能有一定增強作用，這與呂子君等[18]的研究結(jié)果一致，螺旋藻對肝胰臟有保護作用。其中添加3.2%的鈍頂螺旋藻效果最為明顯，分別使GOT和GPT活力分別下降30%和40%以上。而添加0.8%鈍頂螺旋藻使異育銀鯽血漿中的GOT和GPT活力升高，有可能是因為試驗對象不同及添加的螺旋藻差異造成的。

3.5 添加不同比例的鈍頂螺旋藻對異育銀鯽腸道消化酶活力的影響

消化酶是生物中不可缺少的一種蛋白質(zhì)，消化酶具有高度催化功能和專一性，腸道消化酶可促進食物中糖、脂肪、蛋白質(zhì)的水解。

已有試驗表明，微藻中的活性成分可以調(diào)節(jié)消化酶的活性，不同濃度的微藻活性成分能夠提高或抑制消化酶的活性[25]。公緒鵬等[26]在試驗中表明蛋白質(zhì)和能量交互作用使蛋白酶活力、淀粉酶活力等顯著升高（P＜0.05），鈍頂螺旋藻中蛋白質(zhì)含量高達60%，能夠提高基礎(chǔ)飼料的蛋白質(zhì)含量。本試驗中蛋白酶活力隨鈍頂螺旋藻添加比例的增加呈增加趨勢，且1.6%和3.2%組與0%組相比差異顯著（P＜0.05），與前人結(jié)果相似。寧博[27]研究表明Na+、K+、Ca2+對血鸚鵡、唇骨魚的脂肪酶活力多為抑制作用。本試驗脂肪酶活力在1.6%、3.2%組受到抑制，與0%組相比顯著降低（P＜0.05），可能是因為螺旋藻中含有較為豐富的Na+、K+、Ca2+、Fe2+等離子，故對脂肪酶活力存在抑制作用[28]。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，鈍頂螺旋藻可以提高異育銀鯽抗氧化力和非特異性免疫機能，有效促進異育銀鯽的生長和提升蛋白酶活力，同時鈍頂螺旋藻具有降低肝胰臟毒性的功效，添加鈍頂螺旋藻在3.2%時效果明顯。