王獻(xiàn)剛 馮保靜

牙髓組織中含有未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，Gronthos等[1]發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的增殖能力及多向分化能力，便提出了牙髓干細(xì)胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)的概念。DPSCs因其來(lái)源廣泛、免疫原性低，目前被認(rèn)為是口腔組織工程中最具潛力的種子細(xì)胞[2,3]。牙髓干細(xì)胞位于血管周圍的干細(xì)胞龕內(nèi)[4]，當(dāng)牙髓受到齲壞、磨耗、炎癥等刺激時(shí)牙髓干細(xì)胞大量增殖并遷移至受損部位，繼而分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，形成修復(fù)性牙本質(zhì)，在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，探索牙髓干細(xì)胞遷移能力的機(jī)制對(duì)牙髓組織的損傷修復(fù)具有重要意義。CXCR4作為SDF-1的特異性受體蛋白，參與細(xì)胞遷移、侵襲和粘附等多種生理功能，研究顯示SDF-1α/CXCR4信號(hào)軸對(duì)hDPSCs遷移具有十分重要的調(diào)控作用，阻斷或沉默CXCR4表達(dá)可顯著抑制hDPSCs的遷移能力[6]。

MicroRNA(miRNA，miR)能通過(guò)沉默復(fù)合體miRISC(multiprotein RNA induced-silencing complex)與靶 mRNA 3-UTR(3'-untranslated region)結(jié)合從而抑制靶mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種功能[7]。miR-206是microRNAs家族中的一員，其廣泛參與干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化等[8,9]。研究報(bào)道 miR-206可靶向Hmgb3、TRAF6調(diào)控影響干細(xì)胞的成肌向分化及遷移能力[10,11]。抑制miR-206表達(dá)可顯著抑制Propofol誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞的凋亡[12]，但miR-206是否參與調(diào)控hDPSCs的生物學(xué)特性尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在hDPSCs中轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor和miR-206 mimics，檢測(cè)對(duì)hDPSCs遷移能力的影響，同時(shí)分析、驗(yàn)證miR-206作用的靶基因，探討miR-206調(diào)節(jié)hDPSCs遷移的機(jī)制，為進(jìn)一步探索hDPSCs在牙髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鏈霉素、青霉素、胎牛血清、0pti—MEM(Gibco，美國(guó))；α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))；Transwell小室、六孔培養(yǎng)板(Costar，美國(guó))；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-TEK，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；細(xì)胞孵箱(Heraeus，德國(guó))；離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；miR206 mimics、過(guò)表達(dá)CXCR4質(zhì)粒(銳博生物，中國(guó)；CXCR4抗體(Abcam公司，英國(guó))；Lipofectamine2000(Invitrogen，美國(guó))。

1.2 正常和牙髓炎牙髓組織的獲取及分離 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(本實(shí)驗(yàn)的倫理批準(zhǔn)號(hào)為：AYLY201806001)，患者知情同意下，收集18～30歲即刻拔除的正常狀態(tài)及牙髓炎狀態(tài)的智齒各6顆，從釉牙骨質(zhì)界下1mm左右截?cái)嗪笕〕龉谒?，?jīng)液氮速凍后提取各組牙髓組織RNA，按試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，q-RCR檢測(cè)不同狀態(tài)下miR-206和CXCR4 mRNA水平的表達(dá)情況。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 收集18～24歲志愿者即刻拔除的前磨牙或第三磨牙，無(wú)菌條件下輕輕分離出牙髓組織，1.5mL無(wú)菌EP管中剪成1mm3的組織塊；加入4mg/L I型膠原酶500μL消化45min，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸后將組織塊接種于35mm皿中，于37℃、二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并長(zhǎng)至80%融合率時(shí)，采用有限稀釋法挑選單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3牙髓干細(xì)胞消化后，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分為miR206 mimics、miR206 inhibitor和 miR206對(duì)照組(miR206-NC)，miR-206 inhibitor+CXCR4 沉默組(miR-206+si-CXCR4)、miR-206 inhibitor+CXCR4沉默對(duì)照組組(miR-206+si-NC)，參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)分別對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后通過(guò)qRCR檢測(cè)miR206轉(zhuǎn)染效果。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-RCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá) q-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miR206和CXCR4 mRNA表達(dá)水平。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3牙髓干細(xì)胞消化后，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，miRNA轉(zhuǎn)染后48h，提取miR206 mimics、miR206 inhibitor和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara生物技術(shù)公司)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，儲(chǔ)存于-20℃條件下備用。q-PCR反應(yīng)根據(jù)SYBRRPremix Ex TaqTM(Takara生物技術(shù)公司)說(shuō)明書(shū)操作，miRNA-206上游引物為：5’-ATCCAGTGCG TGTCGTG-3’，下游引物為：5’-TGCTTGGAA TGTAAGGAAG-3’；內(nèi)參U6上游引物為：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物為：5’-AACGCTTCACGA AT T TGCGT-3’；CXCR4上游引物為：5’-GGATGAGGACACTGCTGTA GAG-3’，下游引物為：5’-CTCCTCTTTGTCA TCACGCTTCC-3’；內(nèi)參β-actin上游引物為：5’-AAAGACCTGTA CGCCAACAC-3’，下游引物為：5’-GTC ATACTCCTGCTTGCTGAT-3’。

1.5 Western blotting檢測(cè)hDPSCs中CXCR4蛋白的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3牙髓干細(xì)胞消化后，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，miRNA轉(zhuǎn)染后48 h，PBS漂洗細(xì)胞3次，各加入80μL RIPA蛋白裂解液，在冰上提取細(xì)胞總蛋白后加入蛋白上樣緩沖液變性，制備10%SDS-PAGE凝膠，每孔加入10μL總蛋白，經(jīng)電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人CXCR4(1∶1000稀釋)、GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體，于4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次后，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1h；使用ECL化學(xué)發(fā)光。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以CXCR4/GAPDH表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 miR-206對(duì)hDPSCs遷移能力的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-206對(duì)hDPSCs遷移能力的影響：在24孔板Transwell小室的下層加入600μL培養(yǎng)液，取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，無(wú)血清的a-MEM重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104/mL，以150μ/孔接種于24孔板Transwell培養(yǎng)小室的上層，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；24h后，小心取出Transwell小室，吸凈小室內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗3遍，將Transwell小室轉(zhuǎn)移至另一個(gè)24孔板中，加入適量40g/L多聚甲醛，室溫固定20min后去除多聚甲醛，PBS漂洗3次，用小棉簽輕輕擦去Transwell小室基底膜上層細(xì)胞，然后把Transwell小室移入1g/L結(jié)晶紫染色液中，染色20min后吸棄染液，用雙蒸水洗滌小室3次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移的情況，隨機(jī)選取視野拍照，并統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) miR-206利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4為miR-206的靶基因，為了確定miR-206靶向結(jié)合與 CXCR4的 3’UTR區(qū)，將 CXCR4 mRNA突變型(CXCR4-MUT)和野生型(CXCR4-WT)3’UTR合成，并連接到psiCHENK-2載體質(zhì)粒。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3牙髓干細(xì)胞消化后，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，在牙髓干細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR206-NC、miR206 mimics和CXCR4質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，裂解、收集細(xì)胞，檢測(cè)海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光強(qiáng)度并進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 牙髓炎、正常牙髓組織和hDPSCs中miR-206和CXCR4的表達(dá) qPCR檢測(cè)牙髓炎、正常牙髓組織和hDPSCs中miR-206和CXCR4 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，炎癥牙髓組織和hDPSCs中miR-206的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(圖1A)，而CXCR4的表達(dá)水平均明顯升高(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12,13]。

圖1 牙髓炎、正常牙髓組織及牙髓干細(xì)胞中miR-206和CXCR4的表達(dá)

2.2 miR-206對(duì)牙髓干細(xì)胞的遷移能力的調(diào)控 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hDPSCs遷移能力，結(jié)果顯示：miR206-NC組、miR-206 inhibitor組和miR-206 mimics組遷移的細(xì)胞數(shù)目分別為(67±13個(gè))(144±18個(gè))和(38±6個(gè))，miR-206 mimics組遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照組，而miR-206 inhibitor組則顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2A,B)。

圖2 miR-206調(diào)控牙髓干細(xì)胞的遷移能力(×10)

2.3 miR-206對(duì)CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 qPCR和Western blot檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)miR-206后CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，相對(duì)于對(duì)照組，miR-206 mimics組mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，而miR-206 inhibitor組則明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A,B,C,D)。

圖3 miR-206對(duì)牙髓干細(xì)胞中CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.4 miR-206的靶基因?yàn)镃XCR4 通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR4是miR-206的潛在靶基因，結(jié)果顯示，miR-206 mimics組中的CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(圖3)，CXCR4和miR-206的表達(dá)趨勢(shì)相反，說(shuō)明CXCR4可被miR-206負(fù)向調(diào)控。為了進(jìn)一步證明CXCR4是miR-206的靶基因，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，CXCR4-WT+miR-206 mimics組的熒光比值明顯小于CXCR4-WT+miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)(P＜0.05)。 CXCR4-MUT+miR-206 mimics 組和CXCR4-MUT+miR-NC組的熒光比值分別為0.960±0.052和1.0±0.095，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明miR-206可與CXCR4的3’-UTR區(qū)上的位點(diǎn)結(jié)合，miR-206與CXCR4存在直接負(fù)向調(diào)控關(guān)系。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證CXCR4為miR-206靶基因

2.5 沉默CXCR4能夠逆轉(zhuǎn)miR-206 inhibitor對(duì)牙髓干細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用 為了進(jìn)一步研究miR-206和CXCR4的關(guān)系，本研究在DPSCs中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA，分析共轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA對(duì)牙髓干細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA能夠逆轉(zhuǎn)miR-206 inhibitor對(duì)CXCR4的表達(dá)促進(jìn)(圖5A，B所示)。共轉(zhuǎn)染48h后采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)牙髓干細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，miR-206 inhibitor+CXCR4對(duì)照組(miR-206+si-NC)和miR-206 inhibitor+CXCR4 si-RNA組(miR-206+si-CXCR4)的遷移細(xì)胞數(shù)分別(176±17)個(gè)和(110±10)個(gè)(圖 5C，D)，與 miR-206 inhibitor+CXCR4對(duì)照組相比，miR-206 inhibitor+CXCR4 si-RNA組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明沉默CXCR4的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-206 inhibitor對(duì)牙髓干細(xì)胞的遷移的促進(jìn)作用。

圖5 沉默CXCR4可部分逆轉(zhuǎn)miR-206 inhibitor對(duì)牙髓干細(xì)胞遷移能力的抑制作用(×10)

3.討論

DPSCs位于牙髓中血管周圍的干細(xì)胞龕[4]，一般情況下，其在牙髓中不增殖、分化和遷移，保持未分化的間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體受到齲壞、磨耗等病理性損害時(shí)，DPSCs可迅速增殖、遷移至受損部位[14]，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞形成修復(fù)性牙本質(zhì)隔離外界刺激并修復(fù)受損組織。細(xì)胞遷移是組織損傷修復(fù)的關(guān)鍵步驟，干細(xì)胞可大量增殖并遷移至損傷部位，通過(guò)直接分化為與組織修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞類型或者通過(guò)誘導(dǎo)周圍環(huán)境中的多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行組織修復(fù)。本研究首次探索了miR-206對(duì)hDPSCs遷移能力中的影響，研究結(jié)果顯示抑制miR-206表達(dá)后可促進(jìn)hDPSCs的遷移能力，而抑制miR-206表達(dá)可上調(diào)CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而過(guò)表達(dá)miR-206表達(dá)則結(jié)果相反。檢測(cè)正常和牙髓炎狀態(tài)下牙髓組織和牙髓干細(xì)胞中的miR-206和CXCR4的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)炎癥牙髓組織和牙髓干細(xì)胞中miR-206的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而CXCR4的表達(dá)水平明顯升高，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[13]。MicroRNA作為一類非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中廣泛參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在調(diào)控干細(xì)胞增殖、遷移和分化方面發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控干細(xì)胞組織損傷修復(fù)過(guò)程。研究表明miR-206可通過(guò)調(diào)控多種靶基因，如Hmgb3、Pim-1，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖及遷移能力[9,10]。MiR-206還可通過(guò)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制頭頸鱗狀細(xì)胞癌的遷移能力[15]。細(xì)胞的遷移過(guò)程由多種細(xì)胞趨化因子和信號(hào)通路的相互作用調(diào)控的結(jié)果。例如，SDF-1α/CXCR4可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至內(nèi)皮細(xì)胞[16]；同時(shí)研究顯示SDF-1α/CXCR4信號(hào)軸可通過(guò)FAK/PI3K/AKT/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控hDPSCs的遷移能力[6]。綜上，干細(xì)胞的增殖及遷移能力在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牙髓炎癥狀態(tài)下miR-20和CXCR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明miR-206可調(diào)控hDPSCs的遷移能力及CXCR4的表達(dá)，說(shuō)明在牙髓炎損傷修復(fù)過(guò)程中miR-206在hDPSCs遷移過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

MicroRNAs(miRNAs)從一種約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成小分子RNA，約21-23個(gè)堿基大小，miRNAs在結(jié)構(gòu)上不同于雙鏈結(jié)構(gòu)的siRNA，其機(jī)制也與siRNA介導(dǎo)的mRNA降解有所區(qū)別，microRNA-RISC復(fù)合體對(duì)mRNA靶基因的作用主要取決于其與靶基因轉(zhuǎn)錄本序列互補(bǔ)的程度。本實(shí)驗(yàn)中miR-206與CXCR4序列高度互補(bǔ)，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-206與CXCR4靶向結(jié)合導(dǎo)致CXCR4 mRNA發(fā)生降解，進(jìn)而影響CXCR4蛋白的表達(dá)。

本研究探索了miR-206對(duì)hDPSCs遷移能力中的影響，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-206結(jié)合與 CXCR4的 3’-UTR區(qū)，即 CXCR4為miR-206的靶基因，最后miR-206 inhibitor和CXCR4si-RNA共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了沉默CXCR4的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-206 inhibitor對(duì)牙髓干細(xì)胞的遷移的促進(jìn)作用。由此可以認(rèn)為，miR-206通過(guò)靶向調(diào)控CXCR4對(duì)hDPSCs的遷移能力發(fā)揮重要調(diào)控作用，提示miR-206在hDPSCs參與牙髓組織損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。