李勝丹 梁乙然 劉一涵

骨質(zhì)疏松癥(OP,Osteoporosis)是一類以骨密度降低、骨脆性增加、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的全身性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松兩型。原發(fā)性骨質(zhì)疏松包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和衰老性骨質(zhì)疏松。隨著我國人口老齡化的增加，老年性骨質(zhì)疏松問題愈加嚴(yán)重，不僅表現(xiàn)在四肢軀干骨方面，頜骨質(zhì)量也直接受影響，給臨床口腔種植手術(shù)帶來困難。正常生理狀態(tài)下，成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)介導(dǎo)的骨吸收保持平衡，以維持骨穩(wěn)態(tài)。發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，此平衡被打破，骨吸收大于骨形成，造成骨丟失[2]。而間充質(zhì)干細(xì)胞是組織再生的基礎(chǔ)，在衰老性骨質(zhì)疏松條件下，以往研究大多集中在四肢軀干骨來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,本文則著重研究衰老性骨質(zhì)疏松微環(huán)境對(duì)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并探究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器 2月齡和20月齡SPF級(jí)SD大鼠(解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心)；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，USA)；PBS、青霉素、鏈霉素、胰酶、甲苯胺藍(lán)染色液、茜素紅粉劑、二甲基亞砜(索萊寶，北京)；堿性磷酸酶試劑盒、成骨誘導(dǎo)液(Sigma，USA)；CCK-8試劑盒(碧云天，上海)；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Takara，Japan)；引物(生工，上海)；CD29-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC(Biolegend，USA)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)；倒置相差顯微鏡及照相系 統(tǒng) (OLYMPUS， Japan)； Micro-CT(Siemens，Germany)；全波長酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，USA)；RT-PCR儀器(AXYGEN，USA)；流式細(xì)胞儀(BD，USA)；離心機(jī)(Heraens Cryofuge 8000，Germany)。

1.2 自然衰老骨質(zhì)疏松大鼠模型的確立 取2月齡和20月齡SD大鼠各用3%戊巴比妥鈉腹腔過量注射致死后，分離兩組大鼠頜骨及股骨，并分別進(jìn)行Micro-CT掃描，觀察分析兩組大鼠頜骨和股骨骨密度及骨小梁相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.3 兩組大鼠JBMMSCs體外分離、培養(yǎng)和鑒定

1.3.1 JBMMSCs體外分離、培養(yǎng) 取2月和20月齡SD大鼠麻藥過量致死，75%乙醇消毒15分鐘，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取雙側(cè)下頜骨，仔細(xì)去除下頜骨上附麗的肌肉組織及牙槽骨中牙齒，暴露骨髓腔，取無菌60mm平皿放入5ml α-MEM培養(yǎng)基(置于冰上)，用1ml注射器吸取含10%血清的α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，于37℃，50ml/L CO2孵箱培養(yǎng)。48h半量換液，3天后首次全換液，以后每三天換液一次。待貼壁細(xì)胞長到80%融合后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，0.25mg/mL胰酶37℃消化2min；以2.5×104/cm2密度接種傳代。取P3代細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 JBMMSCs分子表型鑒定 分別取年輕、衰老大鼠生長狀態(tài)良好的P3代JBMMSCs，PBS洗2次，胰蛋白酶消化2min；1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸；調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml后，分裝到1.5ml的離心管中，每管100ul。室溫下分別向每管加入 1ulCD29(PE)、CD90(FITC)、CD34(FITC)、CD45(FITC)抗體，4℃避光孵育30min；PBS洗3次，1000 r／min離心5min；PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分別計(jì)算相對(duì)應(yīng)抗體陽性率(%)。

1.4 兩組大鼠JBMMSCs生物學(xué)功能檢測(cè)

1.4.1 JBMMSCs增殖能力的檢測(cè) 克隆形成實(shí)驗(yàn)：分別取兩組大鼠生長狀態(tài)良好的P3代JBMMSCs，稀釋細(xì)胞濃度為5×103/ml的單細(xì)胞懸液。取1ml分別均勻接種于直徑90mm培養(yǎng)皿，補(bǔ)加7ml α-MEM培養(yǎng)基,十字輕輕混勻后,常規(guī)培養(yǎng)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，10d后終止培養(yǎng)，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗后甲苯胺藍(lán)染色20min，dd水沖洗并拍照。鏡下觀察計(jì)數(shù)：細(xì)胞≥50個(gè)記為一個(gè)克隆，并計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量×100%

CCK-8實(shí)驗(yàn)：分別取兩組大鼠生長狀態(tài)良好的P3代JBMMSCS，以2×103/孔的細(xì)胞量鋪板于96孔板，每孔加入100μl α-MEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，共設(shè)置7組。接種細(xì)胞后每天取出一個(gè)96孔板，向每孔加入10μl CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h以后再次從孵箱取出，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)各孔的吸光度值(OD值)，并記錄結(jié)果。然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.2 JBMMSCs成骨分化能力檢測(cè)

成骨誘導(dǎo)：分別取兩組大鼠生長狀態(tài)良好的P3代JBMMSCs,以1×105/ml的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞伸展至80%融合后，換成骨誘導(dǎo)液(α-MEM中含5mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL維生素C、0.1μmol/L地塞米松和10%FBS)培養(yǎng)，每3天全換液一次。

堿性磷酸酶(ALP)染色：將兩組細(xì)胞分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)7天后用堿性磷酸酶染色試劑盒進(jìn)行ALP染色，染色陽性結(jié)果是胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色的沉淀，染色操作步驟如下：

①cap的fast violet B salt溶于1ml ddH2O后分裝(FVB藍(lán))，50ul/支；

②染色前配固定液

4.9 ml ddH2O

0.1 ml檸檬酸原液(至室溫)

7.5 ml丙酮

③吸出培養(yǎng)基，PBS洗；

④固定30s，ddH2O輕洗45s；

⑤50ul FVB藍(lán)+2.35ml ddH2O混勻；

⑥100ul AS-MX溶液加入5中混勻；

⑦室溫30min，其染液，ddH2O洗一次，留少量水拍照；

⑧陽性結(jié)果是胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀。

茜素紅染色：將兩組細(xì)胞分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)21天以后，吸去原培養(yǎng)液，PBS反復(fù)漂洗后，用4%多聚甲醛溶液固定20min，再用配置好的茜素紅染液進(jìn)行染色30min。PBS沖洗三次后，倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.4.3 Real-timePCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx2、OCN的表達(dá) 分別取兩組大鼠生長狀態(tài)良好的P3代JBMMSCs，以1×105個(gè)cell/孔的量接種到六孔板上，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7d后，提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA的濃度，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Runx2、OCN的引物序列參照表(表1)。PCR的反應(yīng)體系為20μl，擴(kuò)增條件為95℃5s、60℃30s，循環(huán)數(shù)39個(gè)。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)(±s)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 衰老性骨質(zhì)疏松大鼠模型的確立 兩組大鼠經(jīng)Mirco-CT掃描和圖像分析顯示:衰老組大鼠頜骨及股骨骨髓腔較年輕組空虛，骨密度明顯下降(圖1)。兩組骨小梁參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示:衰老組頜骨和股骨骨密度(BMD mg/mm3)、骨小梁數(shù)目(Tb.N 1/mm)均明顯低于年輕組；而骨小梁間距(Tb.Sp μm)明顯大于年輕組，兩組間各參數(shù)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。因此，衰老性骨質(zhì)疏松大鼠模型確立成功。

圖1 兩組大鼠頜骨及股骨Micro-CT掃描圖像

圖2 兩組大鼠頜骨及股骨Micro-CT掃描數(shù)據(jù)分析結(jié)果(*P＜0.05)

2.2大鼠JBMMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 鏡下觀察兩組大鼠JBMMSCs形態(tài)發(fā)現(xiàn)，年輕組和衰老組JBMMSCs都呈長梭形，與年輕組JBMMSCs相比，衰老組JBMMSCs細(xì)胞表面積較大，長寬比例降低(圖 3)。

圖3 兩組大鼠JBMMSCs一般形態(tài)比較(10×)

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，年輕組大鼠JBMMSCs表面分子CD29、CD90、CD34、CD45的表達(dá)率分別為98.60%、99.50%、3.15%、4.00%，衰老組大鼠JBMMSCs表面分子CD29、CD90的表達(dá)率分別為97.4%、97.6%，略低于年輕組，CD34、CD45的表達(dá)率分別為4.91%、5.2%，略高于年輕組。結(jié)果表明兩組JBMMSCs均陽性表達(dá)干性相關(guān)分子CD29、CD90，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面分子CD34、CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性(圖4)。

圖4 兩組大鼠JBMMSCs表面抗體表達(dá)結(jié)果

2.3 兩組大鼠JBMMSCs增殖能力比較 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，年輕組和衰老組JBMMSCs的克隆形成率分別為18.19%、5.99%，衰老組克隆形成率明顯低于年輕組(*P＜0.05)(圖5)。

圖5 兩組大鼠JBMMSCs克隆形成能力比較(*P＜0.05)

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，衰老組JBMMSCs增殖能力較年輕組降低，培養(yǎng)后7d各時(shí)間點(diǎn)，兩組OD值相比，從培養(yǎng)后3～7天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)(圖 6)。

圖6 兩組大鼠JBMMSCs生長曲線(*P＜0.05)

2.4 兩組大鼠JBMMSCs成骨分化能力及成骨相關(guān)基因Runx2、OCN表達(dá)水平比較 成骨誘導(dǎo)7天后ALP染色結(jié)果顯示：兩組均有藍(lán)色沉淀產(chǎn)生，年輕組生成的藍(lán)色沉淀量高于衰老組(圖7)，且經(jīng)Image J軟件半定量分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.01)。

圖7 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導(dǎo)后ALP染色及半定量分析

成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色結(jié)果顯示:對(duì)年輕組和衰老組JBMMSCs進(jìn)行礦化誘導(dǎo)21天后，可見到細(xì)胞復(fù)層生長，染色后可看到明顯的礦化結(jié)節(jié)，衰老組礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量低于年輕組，染色也較淺(圖8)，且經(jīng)Image J軟件半定量分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)。

圖8 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色及半定量分析

Real-time PCR檢測(cè)顯示，衰老組JBMMSCs成骨誘導(dǎo)后其Runx2 mRNA、OCN mRNA表達(dá)水平均低于年輕組(*P＜0.05)，(圖9)。

圖9 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導(dǎo)后Runx2 mRNA、OCN mRNA表達(dá)水平(*P＜0.05)

3.討論

衰老是自然界各種生命不可抗拒的必然結(jié)果。隨著年齡的增加，機(jī)體各個(gè)器官組織功能均發(fā)生增齡性改變，尤其在骨組織中表現(xiàn)明顯[3]。骨質(zhì)疏松癥是一種退行性疾病，其特征是嚴(yán)重的骨質(zhì)流失,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥是一種復(fù)雜的疾病，為研究此疾病，我們需要生理上相似的模型。據(jù)報(bào)道，SD大鼠超過9個(gè)月大可用于建立與年齡相關(guān)的骨丟失模型[4]，已有研究證明了雄性SD大鼠隨著年齡的增長會(huì)自然發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥[5,6]。因此，本研究選擇自然衰老20月齡SD大鼠作為衰老性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，2月齡大鼠作為年輕組進(jìn)行研究。通過對(duì)兩組大鼠頜骨及股骨骨髓腔Micro-ct掃描發(fā)現(xiàn)，20月齡組頜骨骨密度顯著下降，骨小梁數(shù)目也減少，而骨小梁分離度增加，與付欣等[7]的研究報(bào)道保持一致。表明我們選用的20月齡大鼠骨質(zhì)疏松明顯，可以作為衰老性骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種紡錘形、可黏附的非造血干細(xì)胞，可以從許多組織中分離出來，具有自我更新和多向分化能力，可以分化成各種中胚層細(xì)胞類型，比如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[8]。在骨重建時(shí)，BMSCs募集隨后增殖，譜系承諾，譜系特性標(biāo)記物表達(dá)，膠原蛋白分泌和細(xì)胞基質(zhì)礦化，此連續(xù)級(jí)聯(lián)的生物過程驅(qū)動(dòng)了骨的形成[9]。有學(xué)者研究表明，老年小鼠來源的BMSCs的數(shù)目、增殖能力與年輕小鼠來源的相比明顯降低[10]。當(dāng)MSC發(fā)生衰老時(shí)，其成骨分化能力下降而成脂能力增強(qiáng)[11,12]，提示我們BMSCs的生物學(xué)功能下降可能是導(dǎo)致骨衰老退行性變的重要原因。然而，頜骨與四肢軀干骨胚層來源及成骨方式均不同，前者來源于外胚間充質(zhì)，成骨方式是膜內(nèi)成骨，后者來源于中胚層，成骨方式為軟骨內(nèi)成骨[13～15]。有學(xué)者研究報(bào)道，頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的牙槽骨原位成骨能力要高于四肢軀干骨[16]。在衰老性骨質(zhì)疏松條件下，頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化能力將如何變化目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此展開了針對(duì)性研究，研究結(jié)果顯示，自然衰老大鼠JBMMSCs的增殖、成骨分化能力均較年輕大鼠明顯下降，表明自然衰老骨質(zhì)疏松微環(huán)境下JBMMSCs生物學(xué)功能發(fā)生改變。

Runx2是成骨分化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，有研究表明，Runx2缺失的鼠的成骨細(xì)胞分化完全被抑制，既不能骨膜內(nèi)成骨，也不能軟骨內(nèi)成骨[17]。OCN由成骨細(xì)胞分泌，作為成骨細(xì)胞活動(dòng)的重要標(biāo)志[18]。我們分別對(duì)Runx2和OCN的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示Runx2和OCN在衰老組的表達(dá)明顯低于年輕組，與前面染色結(jié)果一致。表明自然衰老骨質(zhì)疏松微環(huán)境可能通過影響成骨相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)而影響了JBMMSCs的成骨分化功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JBMMSCs隨著增齡其生物學(xué)功能發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為其增殖能力、成骨分化能力降低，這可能是導(dǎo)致衰老性骨質(zhì)疏松的重要原因，但其具體分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待我們進(jìn)一步研究，為延緩和治療衰老性骨質(zhì)疏松提供重要依據(jù)。