黃思聰 龍敏儀

摘 要：采用QuEChERS技術(shù)提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢測方法。結(jié)果表明：在0.1～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，酰胺醇類抗生素及其代謝物質(zhì)量濃度與其質(zhì)譜響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1;檢出限為0.007 5～0.003 0 μg/kg，定量限為0.025～0.100 μg/kg;加標(biāo)回收率為94.3%～97.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～3.7%。

關(guān)鍵詞：酰胺醇類抗生素;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;QuEChERS;牛蛙肉

Abstract： A quick， easy， cheap， effective， rugged and safe （QuEChER） extraction procedure followed by a liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） assay was established for the simultaneous determination of amphenicol antibiotics （chloramphenicol， thiabendazole and florfenicol） and the florfenicol metabolite florfenicol amine （FFA） in bullfrog meat. The results showed that there was a good linear relationship between the mass spectrometric response and concentrations of all analytes in the range from 0.1 to 50.0 ng/mL with correlation coefficients all greater than 0.999 1. The limits of detection and quantitation were in the range from 0.007 5 to 0.003 0 μg/kg and from 0.025 to0.100 μg/kg， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range from 94.3% to 97.9%， with relative standard deviation of 0.8% to 3.7%.Keywords： amphenicol antibiotics; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; QuEChERS; bullfrog meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）06-0039-05

引文格式：

黃思聰， 龍敏儀. QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物[J]. 肉類研究， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.? ? http：//www.rlyj.net.cnHUANG Sicong， LONG Minyi. Determination of amphenicol antibiotics and metabolite residues in bullfrog meat by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.? ? http：//www.rlyj.net.cn

牛蛙（Rana catesbiana Shaw），俗名美國水蛙，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的大型食用蛙[1-2]，原產(chǎn)于北美洲和墨西哥[3-4]，因個體碩大、生長快、產(chǎn)量高，且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有滋補(bǔ)解毒功效，已成為世界各大洲養(yǎng)殖的主要食用蛙種[5-7]。但牛蛙在養(yǎng)殖過程中易發(fā)生病毒性、細(xì)菌性、真菌性等疾病，部分養(yǎng)殖場為追求利益而添加大量具有廣譜抗菌功效的氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）等酰胺醇類抗生素[8-9]，但若這些抗生素使用不當(dāng)會殘留在牛蛙肉中，危害消費(fèi)者的健康。毒理學(xué)研究表明，CAP可引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，美國、中國規(guī)定在動物食品中CAP不得檢出;TAP不易引起再生障礙性貧血，但可抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的生成[10-12];FF為CAP和TAP的替代藥物，既克服了易產(chǎn)生耐藥性和造成再生障礙性貧血的缺陷，又具有較強(qiáng)的抗菌活性，且具有抗菌譜廣、吸收好、生物利用度高等特點(diǎn)，但FF具有一定的胚胎毒性，美國[12]、歐盟[13]、中國[14-16]均對TAP和FF的殘留量作了限量規(guī)定。因此，有必要建立牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢測方法。

目前，酰胺醇類抗生素的檢測方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[17]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[19]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[20-22]，但其中GC和HPLC無法提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，靈敏度不高;GC-MS因衍生化處理樣品前處理繁瑣;LC-MS/MS具有分離能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，且操作簡便，適合低殘留多組分同時測定[23-24]。QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）是一種快速的樣品前處理技術(shù)，具有回收率高、準(zhǔn)確度高、分析速度快等特點(diǎn)，QuEChERS-LC-MS/MS已用于水產(chǎn)品和畜禽產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥殘留檢測[25-26]。本研究采用QuEChERS技術(shù)提取凈化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代謝物氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA），建立LC-MS/MS法同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAP、TAP、FF、FFA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于99%）? ?德國Dr.Ehrenstorfer公司;N-丙基乙二胺（分析純）美國CNW公司;氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純）? ?天津龍騰化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS 8050高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、AUW220D電子分析天平 日本島津株式會社;JJ-2B勻漿機(jī) 江蘇常州金壇區(qū)西城基銘實(shí)驗(yàn)儀器廠;VORTEX旋渦混合器 上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司;Scientz-800 CQ超聲波提取振蕩反應(yīng)器 寧波新芝生物科技股份有限公司;Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī) 德國Beckman公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;TTL-DC氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;中性氧化鋁柱（規(guī)格500 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精密稱取粉碎混勻5.0 g牛蛙肉樣品置于50 mL離心管中，依次加入純乙腈10 mL、無水硫酸鎂3 g、氯化鈉2 g和乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA）150 mg，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩提取10 min（頻率40 kHz，功率800 W），10 000 r/min離心5 min;上清液經(jīng)中性氧化鋁柱凈化，用3 mL乙腈淋洗，收集流出液，45 ℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液供LC-MS/MS測定。

1.3.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取酰胺醇類抗生素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）;流動相A為乙腈，流動相B為純水;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10.0 μL;柱溫40 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，20%流動相A;1～2 min，20%～60%流動相A;2～3 min，60%～95%流動相A;3～8 min，95%流動相A;8～8.1 min，95%～20%流動相A;8.1～10 min，20%流動相A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負(fù)離子掃描;掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）;碰撞氣：氬氣，純度>99.99%;加熱氣：氮?dú)?，流?0 mL/min;霧化氣：氮?dú)猓魉? mL/min;干燥氣：氮?dú)?，流?0 mL/min;接口溫度300 ℃;脫溶劑管溫度250 ℃;加熱模塊溫度400 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，結(jié)果表示為平均值，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.0 μg/mL酰胺醇類抗生素單標(biāo)以在線流動注射方式進(jìn)樣。由于酰胺醇類抗生素結(jié)構(gòu)式中含有氟、氯、羥基等官能團(tuán)，在ESI源負(fù)離子模式下可產(chǎn)生帶負(fù)電荷的分子離子峰[M-H]-，故選擇負(fù)離子掃描模式，在50～500 m/z范圍內(nèi)進(jìn)行母離子掃描;通過自動優(yōu)化模式，找出豐度較強(qiáng)的碎片離子，選擇豐度最強(qiáng)的碎片離子為定量離子，優(yōu)化后的碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)如表1所示。

2.2 色譜柱的選擇

以酰胺醇類抗生素及其代謝物的峰面積和分離度為指標(biāo)，分析Diamonsil C18、Agilent Zorbax SB C18、Waters X-Bridge C18、Shim-pack ODS C18和Shim-pack GIST C18等不同色譜柱對牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的分離效果。結(jié)果表明：在相同流動相條件下，Shim-pack GIST C18色譜柱可有效分離酰胺醇類抗生素及其代謝物，更適合分析各目標(biāo)物;采用粒徑（2.0 ?m）和內(nèi)徑（2.1 mm）相同的Shim-pack GIST C18色譜柱，50 mm柱用時短，但不能保證目標(biāo)物均有良好的峰形，而100 mm柱用時較短，且各目標(biāo)物峰形尖銳、對稱，酰胺醇類抗生素及其代謝物的提取離子總離子流圖如圖1所示。酰胺醇類抗生素單標(biāo)質(zhì)量濃度10.0 ng/mL。

2.3 流動相的選擇

采用Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）作為分析柱，考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨等流動相對酰胺醇類抗生素及其代謝物的分離效果及其質(zhì)譜響應(yīng)情況。結(jié)果表明：在ESI源負(fù)離子模式下，水相采用純水比采用0.1%甲酸或10 mmol/L乙酸銨更容易使酰胺醇類抗生素及其代謝物電離形成帶負(fù)電荷的分子離子峰[M-H]-，且峰形良好;有機(jī)相采用乙腈比采用甲醇具有更好的分離效果和靈敏度;采用乙腈-水為流動相時，酰胺醇類抗生素及其代謝物的質(zhì)譜響應(yīng)值較高，且經(jīng)梯度洗脫后可有效分離

2.4 QuEChERS提取溶劑的選擇

根據(jù)酰胺醇類抗生素及其代謝物的極性，結(jié)合QuEChERS前處理方法，選擇乙腈、酸化乙腈（0.1%鹽酸）、二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取溶劑，通過空白牛蛙肉加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取效果的比較。結(jié)果表明：乙腈和酸化乙腈對酰胺醇類抗生素及其代謝物的提取效果最好，提取回收率為86.3%～98.6%，這可能是由于牛蛙肉中脂肪和蛋白質(zhì)含量高，乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白質(zhì)和提取能力比較強(qiáng)，結(jié)合QuEChERS方法（無水硫酸鎂脫水、PSA吸附糖類、脂肪酸等有機(jī)酸及色素）與固相萃取凈化（中性氧化鋁柱吸附極性物質(zhì)和除脂）可有效去除蛋白質(zhì)和脂肪，但酸化乙腈提取物中殘留的酸會對酰胺醇類抗生素的質(zhì)譜檢測產(chǎn)生干擾，重現(xiàn)性不理想;乙酸乙酯對酰胺醇類抗生素的提取效果較好，但對FFA提取效果較差，提取回收率約為82.7%;二氯甲烷對目標(biāo)物的提取效果較好，但二氯甲烷提取物中脂肪和蛋白質(zhì)較多，影響后續(xù)凈化，且耗時。因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的消除

為消除LC-MS/MS法測定牛蛙基質(zhì)中酰胺醇類抗生素及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法分析純乙腈和不含目標(biāo)物的空白牛蛙樣品中的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）[20]。

由表2可知：在純乙腈和不含目標(biāo)物的空白牛蛙樣品2 種基質(zhì)中分別加入10、250、500 μg/kg酰胺醇類抗生素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述QuEChERS-LC-MS/MS法測定目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，重復(fù)測定6 次，計(jì)算所得ME值為2.4%～5.3%，說明采用QuEChERS-LC-MS/MS法測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物時不存在基質(zhì)干擾。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

依次配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、10.0、50.0 ng/mL的酰胺醇類抗生素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述LC-MS/MS法進(jìn)行測定，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由表3可知：在0.1～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，酰胺醇類抗生素及其代謝物質(zhì)量濃度與其質(zhì)譜響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1。采用國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）推薦的方法，對11 份不含目標(biāo)物的空白牛蛙樣品進(jìn)行加標(biāo)測定，以3 倍信噪比（RS/N=3）為方法檢出限，以10 倍信噪比（RS/N=10）為方法定量限，得酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢出限為0.007 5～0.030 0 μg/kg，定量限為0.025～0.100 μg/kg。

2.7 加標(biāo)回收率和精密度

在不含目標(biāo)物的空白牛蛙樣品中分別加入0.1、25.0、50.0 μg/kg酰胺醇類抗生素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述LC-MS/MS法進(jìn)行測定，每個添加水平測定6 次，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知：在0.1～50.0 μg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)，酰胺醇類抗生素及其代謝物的平均加標(biāo)回收率為94.3%～97.9%，RSD為0.8%～3.7%，符合方法學(xué)的要求，表明該法準(zhǔn)確度高、精密度好。

2.8 實(shí)際樣品分析

按本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法測定30 份市售牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物殘留量，結(jié)果表明，2 份樣品中分別檢出含有CAP、TAP殘留，其中CAP殘留量高達(dá)187.3 μg/kg，這可能是由于牛蛙飼養(yǎng)過程中感染病毒性、細(xì)菌性等疾病，使用酰胺醇類抗生素藥物殘留所致，市場監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)督檢驗(yàn)。

2.9 與文獻(xiàn)方法比較

將本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[20-24]、國家標(biāo)準(zhǔn)[27-28]及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[29-30]的相關(guān)檢測方法進(jìn)行比較，并從儀器、檢測對象、檢出限、精密度和回收率等方面進(jìn)行比較。

由表5可知，采用QuEChERS方法進(jìn)行樣品前處理，經(jīng)LC-MS/MS對牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物進(jìn)行分析，在檢出限、精密度和回收率等方面均取得較為滿意的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究采用QuEChERS技術(shù)提取凈化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代謝物FFA，成功建立LC-MS/MS法同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的方法。該法前處理簡單、分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可為牛蛙肉中酰胺醇類抗生素殘留檢測及確證提供方法。

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