段麗芬，王惠萍，孫 瑩，王春霞，王左華，張 霞，沈 茹

（昆明市兒童醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科

2.檢驗(yàn)科 云南 昆明 650228）

多巴反應(yīng)性肌張力障礙（dopa-responsive dystonia，DRD）又稱Segawa病，或伴有明顯晝夜波動(dòng)的遺傳性進(jìn)行性肌張力障礙，由日本學(xué)者Segawa發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。DRD的主要臨床表現(xiàn)為肌張力障礙、癥狀多有晨輕暮重現(xiàn)象、小劑量多巴制劑有顯著持久的療效［1］。DRD可分為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant，AD）和常染色體隱性遺傳（autosomal recessive，AR），AD-DRD的致病基因有三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶1（guanosine triphosphate cyclohydrolase 1，GCH-1）基因以及DYT14基因，GCH1基因?yàn)樽畛Ｒ姷闹虏』颍?］。AR-DRD的致病基因?yàn)門H基因和SPR基因，均較為少見，TH基因突變所致的DRD是一種罕見但可治的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，因此對(duì)攜帶有該基因突變的家系進(jìn)行遺傳分析尤為重要，目前國(guó)內(nèi)鮮有TH基因致病的DRD家系報(bào)道，現(xiàn)將我院神經(jīng)內(nèi)科診斷的一個(gè)家系中2例隱性遺傳的DRD患者進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集

研究對(duì)象為2016年2月就診于我院，來自云南省曲靖市白水鎮(zhèn)一山區(qū)的家系（圖1，表1）。病例經(jīng)小兒神經(jīng)內(nèi)科專家進(jìn)行病史詳細(xì)詢問和詳細(xì)體格檢查，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)符合Nygaard等提出的DRD診斷標(biāo)準(zhǔn)。家系中2例患者和1例無癥狀姐姐的臨床表現(xiàn)見表1，I1、I2、I3、I4未能進(jìn)行基因檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試患兒及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

圖1 DRD患者家系圖Fig.1 Pedigree of DRD patients

表1 多巴反應(yīng)性肌張力障礙一家系2例患者和1例無癥狀親屬的臨床特點(diǎn)Table 1 Clinical characteristics of 2 patients and 1 asymptomatic relationship in a family with dopa reactive dystonia

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 抽取患者及親屬外周血各2 mL置于帶有EDTA抗凝的采血管中，采用QiagenFlexiGene DNA Kit提取試劑盒（德國(guó)，Qiagen公司）提取血液樣本的基因組DNA。提取的DNA采用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定其含量。確保樣本基因組DNA的A260/280范圍在1.8～2.0，500 ng/μL ＞ DNA濃度100 ng/μL，基因組總量大于3.5 μg，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)基因組完整性。

1.2.2 二代測(cè)序檢測(cè) 對(duì)已經(jīng)提取的DNA構(gòu)建DNA樣本文庫，文庫共包含31 654條捕獲探針，總大小為1.035 Mbp。然后進(jìn)行肌張力及運(yùn)動(dòng)障礙的已知致病基因包檢測(cè)（共含256個(gè)），同時(shí)隨機(jī)選取我院體檢的50名健康兒童外周血作為對(duì)照（男性27名，女性23名，平均年齡5歲，最小4個(gè)月，最大14歲，中位數(shù)：4歲，漢族44例，少數(shù)民族6例，昆明市籍20例，地州籍30例）。測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)Fastq文件，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析、注釋獲得初步檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)數(shù)據(jù)篩選及臨床比對(duì)，篩選出TH基因c.1481C ＞ T（p.Thr494Met）、c.943G＞A（p.Gly315Ser）兩個(gè)位點(diǎn)，作為可疑位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 一代測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)先證者及其家系出現(xiàn)的位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。在人類基因組數(shù)據(jù)庫GenBank中獲得上述突變位點(diǎn)基因序列，運(yùn)用Primer Z設(shè)計(jì)引物并合成（表2）。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 10 min后，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃延伸5 min PCR擴(kuò)增后，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證（ABI 3730一代測(cè)序儀），將獲得序列與之前的序列進(jìn)行比對(duì)，排除掉二代測(cè)序中假陽性的位點(diǎn)。

表2 反應(yīng)體系引物的堿基序列Table 2 Primer sequence of reaction system

2 結(jié)果

2.1 基因突變分析

測(cè)序結(jié)果（圖2）顯示家系中2例患者TH基因外顯子14、外顯子9存在c.1481C＞ T（p.Thr494Met）、c.943G＞A（p.Gly315Ser）復(fù)合雜合突變，導(dǎo)致蛋白功能受影響，兩個(gè)雜合突變中前者來源于母親，后者來源于父親，先證者二姐和50名正常對(duì)照者均未檢測(cè)到該突變。

圖2 該家系TH基因測(cè)序結(jié)果Fig.2 The results of sanger sequencing of the TH gene fromⅢ3，Ⅲ1，Ⅱ1，Ⅱ2 andⅢ2 samples were as follows

2.2 蛋白功能軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)上面提到的兩個(gè)錯(cuò)義突變分別進(jìn)行Ployphen2、Sift和Mutationtaster蛋白功能軟件預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果提示c.1481C ＞T（p.Thr494Met）、c.943G ＞A（p.Gly315Ser）突變位點(diǎn)可能對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生損害（圖3）。

圖3 PolyPhen-2軟件對(duì)致病性的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of pathogenicity by PolyPhen-2 software

3 討論

DRD是一種罕見的常染色體遺傳性疾病，它是由于基因缺陷導(dǎo)致多種酶合成不足而使多巴胺生物合成受阻引起的臨床癥狀，因遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致DRD有不同臨床表型，典型表現(xiàn)為兒童期或青少年起病，多以下肢肌張力障礙或步態(tài)異常為首發(fā)癥狀，之后逐漸出現(xiàn)全身進(jìn)行性肌張力障礙，臨床癥狀有顯著晨輕暮重，對(duì)小劑量左旋多巴有戲劇性和持續(xù)性的效果。DRD部分患者會(huì)出現(xiàn)下肢反射亢進(jìn)、肢體痙攣等，極易誤診為腦性癱瘓、少年帕金森、足下垂、遺傳性痙攣性截癱等，長(zhǎng)期得不到正確醫(yī)治可能會(huì)帶來肢體畸形或廢用性改變，Tadic［3］統(tǒng)計(jì)了 1952 年至 2011 年間576例DRD患者起病中位數(shù)年齡為11.6歲，從起病到延誤診斷的中位數(shù)為13.5年，DRD在全球范圍內(nèi)誤診率極高，特別是在癥狀不典型的嬰兒和幼兒中。

在DRD患者中首先發(fā)現(xiàn)的基因?yàn)镚CH1基因也是目前報(bào)道最多的基因［4］，其次為 TH、SPR、PTS、PCBD、QDPR和PARK2基因［5］。TH由TH基因編碼，TH基因定位于11p15.5，含14個(gè)外顯子，目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道的TH基因變異位點(diǎn)共有67個(gè)（來自HGMD數(shù)據(jù)庫），其中TH基因突變類型有錯(cuò)義突變、無義突變，剪切位點(diǎn)突變，小的缺失和插入，臨床常見為錯(cuò)義突變，本次家系檢測(cè)結(jié)果為錯(cuò)義突變，和已經(jīng)報(bào)道過的TH基因的突變類型多為錯(cuò)義突變是一致的。TH是兒茶酚胺（多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素）合成的關(guān)鍵限速酶，以分子氧和酪氨酸為底物，BH4為輔因子，催化左旋酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮喟?，該酶缺陷?dǎo)致基底節(jié)突觸間的多巴胺耗竭，患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙或非運(yùn)動(dòng)功能障礙如：情緒波動(dòng)、語言記憶缺陷和專注困難等［6］，本次研究檢測(cè)出TH基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)，其中一個(gè)位點(diǎn)為已報(bào)道過的c.1481C＞T（p.Thr494Met）突變位點(diǎn)［7］，為致病性突變，另外一個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)c.943G＞A（p.Gly315Ser），檢索HGMD、NCBI數(shù)據(jù)庫該突變?yōu)槲磮?bào)道過的新突變?；純焊改妇鶠閿y帶者，符合常染色體隱性遺傳方式。正常家系成員及50名正常對(duì)照個(gè)體未檢測(cè)到該突變，說明這兩個(gè)突變可能是該家系的致病性突變。運(yùn)用Ployphen2、Sift和Mutationtaster蛋白功能軟件預(yù)測(cè)，均證實(shí)突變位點(diǎn)很可能對(duì)蛋白質(zhì)功能造成損害，兩例患兒臨床癥狀符合DRD的診斷同時(shí)也通過良好療效驗(yàn)證了該診斷，進(jìn)一步說明該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兊目赡苄暂^大。

TH基因缺陷的DRD較GCH1基因突變所致的DRD起病早、臨床癥狀重，多在出生后數(shù)周到5歲間起病，常為下肢起病的部分或全身性肌張力不全，70%在15歲前即可出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，可表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲滯的多巴反應(yīng)性嬰兒帕金森或嚴(yán)重進(jìn)展性腦病表現(xiàn)等［8］。本家系中先證者為下肢起病，早期晨輕暮重現(xiàn)象明顯，符合該病特點(diǎn)，TH缺陷的DRD晚期晝夜波動(dòng)性可消失，先證者大姐病程長(zhǎng)，癥狀嚴(yán)重?zé)o晝夜波動(dòng)性，曾被誤診為腦性癱瘓十余年。TH基因突變的DRD分為3個(gè)表型［9］：①嬰幼兒進(jìn)行性腦?。罕憩F(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯、波動(dòng)性的錐體外系癥狀、視覺和植物神經(jīng)癥狀，左旋多巴治療癥狀會(huì)有所改善但不持續(xù)不常久。②左旋多巴敏感的嬰幼兒帕金森綜合征：嬰兒起病的嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙但對(duì)左旋多巴有較好的敏感性，先證者大姐出生后既有嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙，無晨輕暮重現(xiàn)象，小劑量左旋多巴療效顯著故考慮為該類型。③典型的DRD：下肢起病的肌張力不全，多有晨輕暮重表現(xiàn)，小劑量左旋多巴治療療效顯著，先證者為該類型。本研究中兩例患者基因突變位點(diǎn)完全相同，然而先證者表現(xiàn)為典型的DRD表現(xiàn)，先證者大姐則為左旋多巴敏感的嬰幼兒帕金森綜合征，兩者臨床嚴(yán)重程度和起病年齡均不同，考慮可能為基因的遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致酶缺陷程度不同而出現(xiàn)不一樣的臨床表現(xiàn)。鑒于DRD的罕見性及缺乏臨床癥狀特異性，臨床醫(yī)生單憑臨床表現(xiàn)很難早期識(shí)別，可提供的可靠診斷依據(jù)少導(dǎo)致臨床能確診的病例數(shù)更少。目前基因檢測(cè)可以作為一種可靠的手段進(jìn)一步明確診斷，將來隨著測(cè)序成本的降低，可望采用基因測(cè)序的方法作為肌張力障礙的常規(guī)診斷篩查方法。雖然DRD具有高誤診率和致殘率，但是治療和改善預(yù)后卻有良好的臨床療效，有望未來能列入新生兒基因篩查的疾病譜中。

DRD需與運(yùn)動(dòng)障礙性疾病如：腦性癱瘓相關(guān)肌張力障礙、少年型帕金森病、肝豆?fàn)詈俗冃浴d攣性截癱、脊髓性肌肉萎縮癥等鑒別。其晨輕暮重現(xiàn)象應(yīng)與重癥肌無力相鑒別，但晝夜波動(dòng)不是DRD特異性的表現(xiàn)，其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病等也可能出現(xiàn)晝夜波動(dòng)性［10］，而對(duì)左旋多巴的顯著和持久的反應(yīng)性是鑒別DRD和其他肌張力不全和帕金森病的重要特征［9］。左旋多巴是DRD最首選的治療，大部分患者對(duì)小劑量左旋多巴有戲劇性和持久性的療效，有報(bào)道0.4 mg/kg起始既能顯著改善臨床癥狀［11］，有治療了30年療效仍持續(xù)有效的報(bào)道［7］，本研究家系中先證者服用左旋多巴每千克體質(zhì)量1.5 mg當(dāng)天既有明顯效果，先證者大姐臥床11年，經(jīng)治療后取得扭轉(zhuǎn)性效果，現(xiàn)已能基本正常生活，左旋多巴副作用小，故懷疑DRD的患者均可試驗(yàn)性治療以免漏診DRD貽誤治療時(shí)機(jī)。Wijemanne等［12］的研究建議疑似DRD的病例均可進(jìn)行左旋多巴試驗(yàn)，假如1個(gè)月后仍無反應(yīng)試驗(yàn)終止。一旦試驗(yàn)有反應(yīng)，立即進(jìn)行下一步檢查，基因診斷將有助于DRD的盡早診斷。

DRD是一種有較好治療效果的常染色體遺傳病，遺憾于目前其漏診率和誤診率極高，如患兒未得到及時(shí)有效治療可導(dǎo)致嚴(yán)重肢體殘障。TH基因突變DRD病例相對(duì)少見容易遺漏，我們對(duì)TH基因家系進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的TH基因突變位點(diǎn)，擴(kuò)展了DRD的基因型與臨床表型的關(guān)系譜。疑似DRD病例可常規(guī)進(jìn)行左旋多巴試驗(yàn)或小劑量左旋多巴實(shí)驗(yàn)性治療，如試驗(yàn)陽性、起病早、臨床癥狀重的患兒需盡早完善TH基因檢測(cè)協(xié)助診斷。應(yīng)增強(qiáng)兒科、康復(fù)醫(yī)療人員對(duì)DRD的認(rèn)識(shí)，在臨床、基因分析基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳咨詢實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，診斷病例及早治療，降低致殘率。

（致謝：康旭醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所在基因檢測(cè)分析過程中給予的技術(shù)指導(dǎo)。）