吳曉利，張志明，何冬旭

（江南大學(xué)1.生物工程學(xué)院，2.國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無(wú)錫214122）

鎘（cadmium，Cd）是中國(guó)土壤的主要重金屬污染物之一。Cd 在人體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá)30～40 年，是最易在人體內(nèi)積聚的有毒重金屬之一，具有致畸性和致癌性[1-4]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已確認(rèn)Cd 及其化合物為Ⅰ類(lèi)致癌物。

環(huán)境污染和職業(yè)接觸均可造成Cd 中毒，Cd 及含Cd 化合物主要從呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)[5-6]。其中，Cd污染食品的攝入是人體Cd暴露的主要途徑。食物中的Cd 在攝入后，首先經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，之后在肝、腎、骨骼及其他組織中蓄積[7-8]，該過(guò)程伴隨著消化道、肝、腎等組織的損傷，臨床典型癥狀主要表現(xiàn)為腸胃炎、肝功能異常、腎炎和骨質(zhì)疏松等。由于肝、腎損傷是Cd 中毒中最為典型的癥狀，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其損傷的評(píng)價(jià)方法和機(jī)制研究有較多報(bào)道[9-10]。相比而言，針對(duì)胃腸道Cd損傷的研究較少，損傷機(jī)制尚不明確。因此，本研究利用小鼠Cd中毒模型探討Cd對(duì)十二指腸的損傷作用及其機(jī)制，進(jìn)一步闡明Cd的毒性作用，并為Cd中毒患者的腸道損傷護(hù)理提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

CdCl2（CdCl2·5/2 H2O）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞核熒光染料DAPI 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰島素購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司；表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自美國(guó)派普泰克公司；膠原酶XI購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；DMEM 培養(yǎng)基和Cd/鉛綠色熒光探針Leadmium Green AM購(gòu)自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；兔抗小鼠活化的胱天蛋白酶3多克隆抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；小鼠抗小鼠E-鈣黏蛋白單克隆抗體購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；小鼠抗小鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體、Alexa Fluor?488 驢抗小鼠IgG（H+L）抗體購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；CellTiter-Blue?細(xì)胞活力試劑盒購(gòu)自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

Synergy H4 全功能微孔板檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；C6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)碧迪公司。

1.2 動(dòng)物和分組

6 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（蘇）2016-0012。小鼠飼養(yǎng)在江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，光照12 h，環(huán)境濕度50%，溫度22～25℃，自由進(jìn)食飲水。

小鼠隨機(jī)分成染毒組和正常對(duì)照組，參照文獻(xiàn)[11-12]的Cd中毒劑量和方法，連續(xù)30 d每天1次ig給予小鼠CdCl210 mg·kg-1或生理鹽水，建立慢性Cd中毒小鼠模型；參照文獻(xiàn)[11，13-14]的Cd中毒劑量和方法，單次ig給予CdCl280 mg·kg-1或生理鹽水，建立急性Cd中毒小鼠模型，并持續(xù)觀察小鼠生存狀況和生存率。

1.3 十二指腸上皮細(xì)胞的制備與培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[15-17]，小鼠脫頸處死，取十二指腸2～3 cm，轉(zhuǎn)移至PBS中，移液管多次沖洗腸內(nèi)容物。剪切組織至約2 mm大小，加入膠原酶Ⅺ0.3 g·L-1，37℃水浴震蕩消化3 次，每次5 min，靜置，棄上清液；再加入膠原酶Ⅺ0.3 g·L-1，37 ℃水浴震蕩消化3 次，每次10 min，靜置，上清液均收集至新的離心管中，100×g離心3 min，將細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、表皮生長(zhǎng)因子1 g·L-1和胰島素0.25 kU·L-1的DMEM）中，于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄未貼壁的細(xì)胞，PBS 清洗2 次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d 后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 十二指腸上皮細(xì)胞的鑒定

將1.3分離培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞以每皿4×104細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗小皿3次，封閉1 h，加小鼠抗小鼠E-鈣黏蛋白一抗（1∶250）4℃孵育過(guò)夜。之后，PBS 清洗并加入Alexa Fluor?488 驢抗小鼠熒光二抗（1∶200），室溫孵育2 h。再加入細(xì)胞核熒光染料DAPI（1∶1000）孵育10 min。最后，避光條件下進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡拍照。Alexa Fluor?488 驢抗小鼠熒光二抗的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為488 和519 nm；DAPI的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為364 和454 nm。

1.5 激光共聚焦檢測(cè)Cd暴露小鼠十二指腸上皮細(xì)胞內(nèi)Cd離子含量

小鼠急、慢性Cd 中毒后24 h，將小鼠處死，按1.3 和1.4 制備和鑒定十二指腸上皮細(xì)胞。將細(xì)胞以每皿4×104接種于共聚焦小皿中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，0.85%氯化鈉溶液清洗3 次，加入5 mg·L-1Leadmium Green AM[18]，37℃避光孵育30 min，0.85%氯化鈉溶液清洗3次，加入0.85%氯化鈉溶液500 μL，使用激光共聚焦顯微鏡于激發(fā)光波長(zhǎng)490 nm 和發(fā)射光波長(zhǎng)520 nm 檢測(cè)熒光強(qiáng)度，表示細(xì)胞內(nèi)Cd離子含量。

1.6 CellTiter-Blue?檢測(cè)體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細(xì)胞。將細(xì)胞以每孔1×104接種于96孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分別與終濃度為0（細(xì)胞對(duì)照組），2.5，5，10，15，20，30，40，50，60，80 和100 μmol·L-1的CdCl2共孵育24 h 后，每孔加入10 μL CellTiter-Blue?檢測(cè)試劑，繼續(xù)孵育4 h，于560 和590 nm 雙波長(zhǎng)下測(cè)吸光度（absorbance，A）值[19]。各組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率（%）=（Cd 處理組A 值/對(duì)照組A 值）×100%，用Logit 法計(jì)算CdCl2抑制細(xì)胞存活的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)小鼠十二指腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細(xì)胞。將細(xì)胞以每孔5×105接種于6 孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h。根據(jù)1.6 所得的IC50值和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞隨機(jī)分為細(xì)胞對(duì)照組和CdCl215 μmol·L-1處理組，分別給藥孵育24 h 后，胰酶消化細(xì)胞。按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明向細(xì)胞懸液中加入碘化丙啶染色液，37℃避光溫育30 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期[20]。每組設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 Western 印跡法檢測(cè)體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細(xì)胞。將細(xì)胞以每孔4×105接種于6 孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h。根據(jù)1.6 所得IC50和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，細(xì)胞隨機(jī)分為細(xì)胞對(duì)照組和CdCl230 μmol·L-1處理組，分別給藥孵育3，6，9 和12 h后，收集細(xì)胞，加入200 μL 細(xì)胞裂解液，4℃裂解細(xì)胞2 h，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉2 h，加活化的胱天蛋白酶3（1∶500）和β 肌動(dòng)蛋白（1∶3000）一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗（1∶5000），室溫孵育2 h后ECL 發(fā)光法顯影，用ImageJ 1.42 軟件分析各蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白IA 比值反映目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量[21]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急性和慢性Cd中毒對(duì)小鼠生存的影響

慢性Cd中毒小鼠染毒后7 d內(nèi)無(wú)死亡，且小鼠活動(dòng)正常（數(shù)據(jù)略）。急性Cd中毒小鼠在染毒第1天即出現(xiàn)萎靡不振，進(jìn)食減少的狀況；第2天部分動(dòng)物出現(xiàn)四肢抽搐、行動(dòng)障礙和死亡；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠生存率逐漸下降，第5天時(shí)小鼠生存率降至40%，第6和第7天生存率維持不變（圖1）。

Fig.1 Survival curve of mice with acute cadmium（Cd）poisoning. Mice were ig given a single dose of CdCl2 80 mg·kg-1 or saline（normal control，NC），and the survival status of mice was recorded for 7 d.

2.2 十二指腸上皮細(xì)胞的鑒定

如圖2 所示，本實(shí)驗(yàn)分離制備的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞多呈扁平短梭狀，貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)E-鈣黏蛋白免疫熒光染色特異性標(biāo)記后呈現(xiàn)綠色熒光，占細(xì)胞總數(shù)＞95%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 急性或慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細(xì)胞中Cd離子含量

結(jié)果如圖3所示，急性或慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相比于各自正常對(duì)照組均顯著增加（P＜0.01），表明Cd 離子在急、慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細(xì)胞中顯著富集。

Fig.2 ldentification of primary duodenal epithelial cells by E-cadherin immunofluorescence staining. The duodenal epithelial cells were separated from mouse duodenum by collagenase Ⅺand cultured in complete medium for 3-4 d. Light microscopy and immunofluorescence image of duodenal epithelial cells that were stained with DAPI（blue）and E-cadherin（green）.

Fig.3 Cd2+content in duodenal epithelial cells of mice with acute and chronic cadmium poisoning by confocal fluorescence detection. Chronic cadmium poisoning model：mice were ig administered with CdCl2 10 mg·kg-1 once per day for 30 d；acute cadmium poisoning model：mice were ig administered with single dose of CdCl2 80 mg·kg-1. After 24 h of the last administration，the duodenal epithelial cells were separated and cultured as described in Fig.2. Cells were incubated with Leadmium Green AM dye（5 mg·L-1）for 30 min，and fluorescence intensity（FI）was detected（A）. B was the quantitative result of A.x±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group.

2.4 Cd 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞存活的影響

如圖4 所示，CdCl2作用24 h 對(duì)十二指腸上皮細(xì)胞活力具有抑制作用，且抑制作用隨濃度的增加逐漸增強(qiáng)。其IC50值為（24.55±0.84）μmol·L-1。

Fig.4 Effect of CdCl2 on viability of mouse duodenal epithelial cells in vitro by CellTiter-Blue?assay. See Fig.2 for the duodenal epithelial cell treatment. Cells were treated with CdCl2 0（cell control），2.5，5，10，15，20，30，40，50，60，80 and 100 μmol·L-1 for 24 h. Cell viability（%）=〔（A560/590 nm of CdCl2-treated group/A560/590 nm of control group〕×100%.±s，n=3.

2.5 Cd 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，相對(duì)于細(xì)胞對(duì)照組，CdCl215 μmol·L-1處理組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加（P＜0.05），S 期和G2/M 期比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示CdCl2可使十二指腸上皮細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制DNA 合成，從而抑制細(xì)胞增殖。

Fig.5 Effect of CdCl2 on cell cycle of mouse duodenal epithelial cells detected by flow cytometry. The duodenal epithelial cells were treated with CdCl2 15 μmol·L-1 for 24 h.B was the quantitative result of A.，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 Cd 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平的影響

檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，隨著CdCl2處理時(shí)間的增加，十二指腸上皮細(xì)胞活化的胱天蛋白酶3 表達(dá)水平逐漸增加。CdCl2處理6，9和12 h的上皮細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組（0 h）活化的胱天蛋白酶3顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），提示CdCl2可使十二指腸上皮細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3表達(dá)量增加，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

Fig.6 Effect of CdCl2 on expressions of cleaved-caspase 3 protein in mouse duodenal epithelial cells by Western blotting. Cells were treated with CdCl2 30 μmol·L-1 for 3，6，9 and 12 h.B was the semi-quantitative result of A.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 h）group.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，一次性ig 給予高劑量的Cd 在短期內(nèi)會(huì)對(duì)小鼠造成嚴(yán)重的損傷，并且急、慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細(xì)胞Cd 離子含量均顯著增加；在離體實(shí)驗(yàn)中，Cd以濃度依賴(lài)方式降低十二指腸上皮細(xì)胞活力，提示經(jīng)消化道進(jìn)入體內(nèi)的Cd 對(duì)十二指腸上皮細(xì)胞造成損傷，且這種損傷作用可能涉及到細(xì)胞周期阻滯和胱天蛋白酶3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

需要指出的是，關(guān)于急性Cd中毒的ig劑量，國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少，曾有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠Cd經(jīng)口急性毒性LD50為150 mg·kg-1[12]，本實(shí)驗(yàn)室前期采用6 周齡C57BL/6小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CdCl2150 mg·kg-1的劑量對(duì)小鼠傷害過(guò)大，腸胃道損傷嚴(yán)重，不利于后期原代細(xì)胞分離培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并參照Z(yǔ)hao 等[11]和Yang 等[13]的ig 劑量，本實(shí)驗(yàn)采用單次ig給予CdCl280 mg·kg-1的劑量建立急性Cd 中毒模型，染毒期間小鼠隨染毒天數(shù)增加逐漸顯示出萎靡不振，飲食減退，并死亡的現(xiàn)象，穩(wěn)定地體現(xiàn)了小鼠每個(gè)中毒階段的反應(yīng)。

Cd 經(jīng)口進(jìn)入體內(nèi)，主要消化吸收的部位在小腸，而十二指腸是小腸吸收的重要的腸段。研究發(fā)現(xiàn)，急、慢性Cd中毒小鼠的十二指腸上皮細(xì)胞中都富集了大量的Cd離子，這些Cd離子的富集可能會(huì)直接打破細(xì)胞本身的離子平衡進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷[22]。胱天蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵性作用[23]，其中胱天蛋白酶3 是凋亡執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞凋亡早期的啟動(dòng)與執(zhí)行過(guò)程中起重要作用，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶[24]。胱天蛋白酶3的激活常被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。本研究結(jié)果表明，隨著CdCl2暴露時(shí)間的增加，十二指腸上皮細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3 表達(dá)量逐漸增加，表明細(xì)胞啟動(dòng)了凋亡程序。細(xì)胞周期同細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控能阻止或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[26]。本研究表明，Cd可使十二指腸上皮細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增多，而S 期和G2/M期細(xì)胞比例相對(duì)減少，可能是因?yàn)镃d 對(duì)十二指腸上皮細(xì)胞DNA損傷較重，超出了機(jī)體細(xì)胞正常存在的損傷修復(fù)調(diào)控體系的修復(fù)能力，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究利用在體動(dòng)物和離體細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Cd誘導(dǎo)小鼠十二指腸上皮細(xì)胞損傷的內(nèi)在機(jī)制可能涉及到胱天蛋白酶3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及細(xì)胞周期阻滯，為Cd 中毒患者的治療和后期護(hù)理提供了一定的理論依據(jù)。