陳 晨＊，彭培佩＊，王 健，黃 芳，王 芃，李山虎，王建剛

（1.河南科技大學醫(yī)學院藥理學與分子生物學實驗室，河南洛陽471023；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所，北京100850；3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州510006）

2018年，全球約有1810萬新發(fā)癌癥病例，其中肺癌占11.6%，是癌癥中診斷率最高的病種[1]。而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%～85%，是全球致死率最高的腫瘤[2]。在NSCLC治療中，肺腺癌占總數(shù)50%以上，是最常見的組織亞型。導致肺腺癌發(fā)生的相關驅(qū)動基因包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、人EGFR2（HER2）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-酪氨酸α 催化亞基、B-Raf 原癌基因和Met 原癌基因（Met proto-oncogene，MET）基因突變及間變性淋巴癌激酶，ROS 原癌基因1 和RET 原癌基因重排[3]。EGFR 又稱Her1 或者ErbB1，是ErbB 受體家族4大成員之一。EGFR 過度表達能激活下游重要的信號通路，從而導致細胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移和血管生成等[4]。在NSCLC 的研究中，EGFR 一直是一個熱點。

對于NSCLC 治療，一個重要的里程碑進展就是發(fā)現(xiàn)EGFR 激活突變是一種有效的治療靶點，進而研發(fā)出具有顯著抗腫瘤活性的一系列EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）。目前為止，已經(jīng)開發(fā)出了3代EGFRTKI 藥物，然而大多數(shù)接受EGFR-TKI 治療的患者經(jīng)常在1～2 年內(nèi)產(chǎn)生耐藥性[5-8]。EGFR-TKI 耐藥最常見的機制之一是EGFR發(fā)生T790M突變，該突變約占獲得性耐藥患者比例的50%～60%[9-10]。第三代EGFR-TKI奧西替尼（osimertinib）克服了由于T790M 突變而產(chǎn)生的耐藥，臨床反應有效率為59%～71%[11-14]。但是隨著時間的推移，患者對奧西替尼也不可避免地產(chǎn)生耐藥性。有文獻指出，EGFR 外顯子20 中的新的C797S 氨基酸突變，是T790M 陽性患者中對奧西替尼耐藥的潛在機制[15]。除了C797 位突變，L798I 突變[16-17]，KRAS或者絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）突變激活的絲裂原活 化 蛋 白 激 酶 激 活 通 路[18]，或 通 過MET 或ERBB2[17，19-21]進行的旁路激活，都是已報道的第三代EGFR-TKI 耐藥機制。盡管如此，目前為止人們對奧西替尼獲得性耐藥機制的了解并不完全。本研究主要是利用CRISPR-Cas9全基因組文庫和人非小細胞肺癌NCI-H1975 細胞篩選對奧西替尼耐藥基因及其分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑和主要儀器

感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α 和DH10b 為本實驗室保存，人NCI-H1975細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心；奧西替尼購于美國Selleck 公司；Genome-scale CRISPR Knock-Out v2.0 pooled libraries（GeCKOv2 libraries）購于美國Addgene 公司；細胞染色體DNA 提取試劑盒購自美國Bimake 公司；pBM23 Toposmart 克隆試劑盒購于北京博邁德生物公司；山羊抗人微管蛋白多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人磷酸化EGFR（phosphorylation of EGFR，p-EGFR）、EGFR和FDX1的多克隆抗體購于英國Abcam公司；兔抗人細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化抗體（phosphorylation of extracellular regulated protein kinases，p-ERK），總聚（ADP-核糖）聚合酶全蛋白〔total-poly（ADP-ribose）polymerase，T-PARP〕多克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司；山羊抗兔和兔抗山羊IgG二抗購于北京中杉金橋生物公司；RPMI 1640，DMEM 高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；二甲亞砜（DMSO）購于美國Sigma 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購于華北制藥有限公司；嘌呤霉素購于美國HyClone 公司；蛋白酶抑制劑和結(jié)晶紫購于美國Amresco 公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、CO2恒溫培養(yǎng)箱和MULTISKAN FC酶標儀均購自美國Thermo 公司；ECL 發(fā)光液購于北京天跟生化科技有限公司；Cell Counting Kit8（CCK8）試劑盒購于東仁化學科技有限公司；5417R低溫高速離心機及5418 臺式常溫離心機購于德國Eppendorf 公司；電泳槽和濕轉(zhuǎn)膜儀購于美國Biorad公司。

1.2 GeCKO v2 libraries擴增及慢病毒包裝

根據(jù)GeCKO v2 libraries 說明書，分別取A、B文庫各1 μL，使用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂氨芐平板，37℃溫箱培養(yǎng)14 h，將A和B庫兩種轉(zhuǎn)化子分別刮下收集，按質(zhì)粒提取試劑盒（美國Axygen 公司）說明書提取質(zhì)粒，并測定濃度，保存在-20℃。文庫擴增后，根據(jù)Lipo3000 試劑盒說明書操作，在HEK293T 細胞中進行病毒包裝，并測定病毒滴度。

1.3 Genome-scale CRISPR 文庫篩選奧西替尼耐藥基因

用GeCKO v2 libraries 來進行全基因組的篩選。NCI-H1975 細胞感染含有全基因組小導向RNA（sgRNA）序列的GeCKO v2 libraries 慢 病毒。控制細胞感染慢病毒感染復數(shù)（multipilicity of infection，MOI）≤0.3，以期確保大部分細胞中每個細胞只能感染1個sgRNA；為保證感染效率，初始病毒感染細胞數(shù)≥3.3×108。因此，使用90個175 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶接種NCI-H1975細胞數(shù)為4.0×106，共接種細胞3.6×108，用嘌呤霉素抗性篩選后算出MOI=0.255，滿足MOI≤0.3的實驗要求。

將嘌呤霉素篩選后的細胞分成3 組，分別為第0天（d 0）細胞組（即為進行奧西替尼篩選當天收集的1/3細胞）、奧西替尼4 nmol·L-1組和細胞對照組，每組細胞數(shù)6×107。奧西替尼開始篩選的當天即將d 0 細胞樣品凍存收集，同時當奧西替尼4 nmol·L-1組和細胞對照組細胞增殖至大致1.2×108時進行傳代，2組細胞分別篩選10代，以確保潛在目的基因的穩(wěn)定富集。篩選結(jié)束后，收集3 組細胞并送上海尋百會生物科技有限公司進行高通量測序和生物信息學分析，分析富集的sgRNA及對應的基因。

1.4 候選耐藥基因鐵氧還蛋白1（ferredoxin 1，F(xiàn)DX1）敲除質(zhì)粒構(gòu)建和細胞系建立

利用CRISPR.V2 載體建立敲除FDX1 基因的慢病毒表達載體，靶向FDX1 的sgRNA 序列，F(xiàn)：CACCGATCCAGCGCGGGACCCAGCG，R：AAACCGCTGGGTCCCGCGCTGGATC；靶向腺相關病毒結(jié)合位點1（adeno-associated virus integration site1，AAVS1）基因sgRNA 序列（對照組），F(xiàn)：CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGAT，R：AAACATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC。引物由北京博邁德生物工程公司合成，4℃保存。使用CRISPR.V2載體按膠回收試劑盒（Axygen公司）說明書進行酶切回收載體片段，將設計的sgRNA 進行退火，將載體片段和退火片段通過T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10b，涂氨芐平板，挑單克隆菌落，搖菌提取質(zhì)粒，并測定濃度，-20℃保存。送北京博邁德生物工程公司進行測序。

為了獲得慢病毒，將293T細胞接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，24 h 后，分別用靶向FDX1 或AAVS1的sgRNA 質(zhì)粒和產(chǎn)生慢病毒顆粒的包裝質(zhì)粒psPAX2以及包膜質(zhì)粒pMD2.G按照4∶3∶1用量共轉(zhuǎn)染細胞，12 h 后換成8 mL 新鮮培養(yǎng)液并分別在24 和48 h 后收取病毒液，將2 次病毒液混合后用0.45 微米孔徑濾器過濾，分裝，留部分于4℃保存待感染目的細胞，其余放在-80℃保存。

將NCI-H1975 細胞接種在100 mm 細胞培養(yǎng)皿中，密度40%～50%。第2天，將4 mL DMEM完全培養(yǎng)液與聚凝胺6～8 g·L-1和4 mL 病毒液混合后替換老的培養(yǎng)液，12 h后換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，2 d 后，細胞密度達到80%～90%時，加入嘌呤霉素1.5 g·L-1篩選72 h。建立sg-FDX1 和sg-AAVS1細胞系。

1.5 細胞染色體DNA提取和測序

按照細胞染色體DNA提取試劑盒的要求，首先將sg-FDX1 細胞接種在30 mm 小皿中，生長密度為80%～90%時吸去培養(yǎng)液，PBS 洗2遍。收取細胞，加入100 μL消化液，充分重懸，55℃水浴30 min；然后在95℃水浴5 min 滅活蛋白酶。DNA 直接進行PCR 擴增，取大約2 μL 擴增產(chǎn)物（50 ng），1 μL T 載體pBM23 和1 μL 10×Toposmart，加離子水補充到10 μL反應體系后在室溫下連接5～15 min，然后將5 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30 min；然后于42℃熱激45 s，冰浴2 min，加入500 μL 無抗性LB培養(yǎng)液后，再置37℃搖床中，165 rpm培養(yǎng)1 h；取200 μL菌液均勻涂抹于氨芐抗性LB平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中。12 h后挑取單克隆菌落，搖菌12 h 送檢測序。PCR 擴增引物：FDX1-F：TGGAGTCTCTCGCGGCCTCA，F(xiàn)DX1-R：GCACTGGAACCAGAGACTC。

1.6 Western 印跡法檢測sg-FDX1 和sg-AAVS1細胞中的FDX1，c-PARP蛋白水平及EGFR和ERK磷酸化水平

將敲除FDX1 和AVVS1 表達的NCI-H1975 細胞分別接種在2 個培養(yǎng)皿中，貼壁后收取細胞Western 印跡法檢測敲除效果。將sg-FDX1 和sg-AVVS1 細胞各接種在4 個培養(yǎng)皿中，分別加入奧西替尼0，30，50 和100 nmol·L-1處理30 h 后收取細胞；用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細胞，利用BCA 比色法在酶標儀570 nm 處檢測吸光度（A570nm）值，測定標準曲線得出蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5×SDS 加樣緩沖液并煮沸10 min，對蛋白進行預變性處理。以10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后，在濕轉(zhuǎn)裝置中以200 mA 進行恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，在5%脫脂奶粉中封閉約30 min。使用5%脫脂奶粉稀釋一抗（1∶1000），在4℃的搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次后加入二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，之后用TBST 洗膜3 次，每次5 min，以ECL法顯影及定影。膠片經(jīng)掃描后用Image J進行積分吸光度分析。以目標蛋白和內(nèi)參蛋白的積分吸光度的比值表示蛋白相對表達水平。

1.7 CCK-8法檢測細胞存活

將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，按每孔3000 個細胞接種到96 孔板中，每組3 個孔，置于CO2培養(yǎng)箱24 h 后，各孔單獨加入奧西替尼0，12，20，30 nmol·L-1處理72 h，或用奧西替尼30 nmol·L-1處理細胞3，5 和7 d 后，去除原孔內(nèi)的培養(yǎng)液后每孔加入100 μL稀釋后的CCK8工作液（按CCK8原液與培養(yǎng)液1∶9 的比例配制）繼續(xù)孵育2 h，利用酶標儀在450 nm處檢測吸光度（A450nm）值，細胞相對存活率（%）=（加藥組A450nm-空白組A450nm）/（正常對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。實驗重復3次。

1.8 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖

當克隆生長到約有10個細胞時，加入奧西替尼12 nmol·L-1，10 d后去除原培養(yǎng)液，加入PBS 洗滌3次，甲醇固定細胞約30 min后，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，用流水緩慢清洗孔內(nèi)剩余染料后放置于室內(nèi)風干。顯微鏡下計數(shù)≥10 個細胞的克隆數(shù)。實驗重復3次取平均值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CRISPR-Cas9文庫篩選NCI-H1975細胞中奧西替尼耐藥基因FDX1

圖1 是通過CRISPR-Cas9 文庫在NCI-H1975細胞中篩選對奧西替尼發(fā)揮耐藥作用的FDX1基因的流程。本研究采用GeCKO v2 libraries 慢病毒文庫感染NCI-H1975細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后建立起全基因組敲除的NCI-H1975細胞系。將該細胞系分成3組，分別命名為第0天組（d 0），奧西替尼4 nmol·L-1處理組和細胞對照組，將奧西替尼4 nmol·L-1組和細胞對照組分別培養(yǎng)篩選10代后，將3組細胞提取全基因組DNA 并且PCR 擴增進行sgDNA 高通量測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其中一種sgRNA 富集，所對應的基因為FDX1。

Fig.1 Genome-wide CRISPR screens identified ferredoxin 1（FDX1）as potential osimertinib resistance gene on NCI-H1975 cells.

2.2 建立的敲除FDX1的NCI-H1975細胞

提取敲除FDX1 的NCI-H1975 細胞（sg-FDX1細胞）的基因組DNA，經(jīng)PCR 擴增sgRNA 靶點兩端的片段并連接T 載體后，送公司測序發(fā)現(xiàn)在靶點位置造成了301 bp 的大片段缺失突變（圖2A）。Western 印跡結(jié)果（圖2B）顯示，sg-FDX1 細胞中FDX1 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01），表明成功構(gòu)建敲除FDX1基因細胞sg-FDX1細胞。

2.3 奧西替尼對sg-FDX1細胞凋亡的作用

Western 印跡結(jié)果（圖3）顯示，奧西替尼50 nmol·L-1處理30 h 后，sg-AAVS1 細胞活化的PARP 顯著升高（P＜0.01），sg-FDX1 細胞活化的PARP無明顯變化。說明敲除FDX1減弱了奧西替尼對細胞凋亡的作用。

2.4 奧西替尼對sg-FDX1 細胞FDX 蛋白表達及EGFR和EGFR蛋白磷酸化的影響

Fig.2 Expression of FDX1 protein in sg-FDX1 cells by Western blotting. A：the sequence result of sg-FDX1 and 301 bp was deleted around the sgRNA target site；B：the FDX1 expression level in sg-adeno-associated virus integration site1（AAVS1）and sg-FDX1 cells；C：the semi-quantitative analysis of B. IA：integrated absorbance.s，n=3. ＊＊P＜0. 01，compared with sg-AAVS1 cells.

Fig.3 Effect of osimertinib on protein expression level of cleaved-poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）in sg-AAVS1 and sg-FDX1 cells by Western blotting. The cells were treated for 30 h. B was the semi-quantitative analysis of A.s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells without osimertinib treatment；##P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells with osimertinib treatment.

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，奧西替尼0，30，50，100 nmol·L-1處理細胞30 h 后，與sg-AAVS1細胞相比，在抑制FDX1 蛋白表達的條件下，sg-FDX1 細胞p-EGFR 和p-ERK 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；2組細胞ERK全蛋白表達水平無明顯差異。而sg-FDX1 細胞中EGFR 全蛋白水平降低（P＜0.01）。表明敲除FDX1 可以減弱奧西替尼對細胞中EGFR 信號及受其調(diào)控的ERK 信號通路的抑制作用。

Fig.4 Effect of osimertinib on phosphorylation levels of EGFR，ERK and FDX1 protein expression in sg-FDX1 cells by Western blotting. A：cells were treated with osimertinib at 0，30，50，100 nmol·L-1 for 30 h；B，C and D：the semiquantitative analysis of A. s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells.

2.5 奧西替尼對sg-FDX1 細胞克隆形成和細胞存活的影響

平板克隆結(jié)果（圖5A，B）顯示，奧西替尼12 nmol·L-1處理10 d，sg-AAVS1和sg-FDX1細胞的克隆形成能力都顯著減弱（P＜0.01），但相比sg-AAVS1 細胞，sg-FDX1 細胞在奧西替尼作用后的克隆形成能力顯著提高（P＜0.01）。CCK8 結(jié)果（圖5C，D）表明，相比sg-AAVS1細胞，奧西替尼0，12，20，30 nmol·L-1作用7 d，或者用奧西替尼30 nmol·L-1分別處理細胞3，5 和7 d，sg-FDX1 細胞增殖能力明顯增強（P＜0.01）。表明敲除FDX1會導致奧西替尼耐藥。

Fig.5 Effect of osimertinib on clonal formation（A，B）and cell survival（C，D）of sg-FDX1 cells. A and B：the cells were treated with osimertinib 12 nmol·L-1 for 10 d. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding without osimertinib treatment group；##P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells with osimertinib treatment. C：cells were treated with the indicated concentrations for 7 d；D：the cells were treated with osimertinib 30 nmol·L- 1 for indicated time points. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding sg-AAVS1 cells.

3 討論

本研究利用CRISPR-Cas9全基因組文庫篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在奧西替尼的作用下，在NCI-H1975 細胞中FDX1的sgRNA發(fā)生了顯著的富集，提示FDX1可能參與了細胞對奧西替尼的耐藥作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當敲除NCI-H1975 細胞FDX1 表達后，奧西替尼對于誘導細胞的凋亡以及對ERGR/ERK信號通路的抑制作用都顯著降低，同時對腫瘤細胞的克隆形成和增殖的抑制作用，相對于sg-AAVS1細胞均顯著降低。這些結(jié)果都表明，F(xiàn)DX1 表達水平改變在NSCLC對于第三代靶向治療藥物奧西替尼的耐藥中發(fā)揮作用。

近年來，隨著CRISPR-Cas9 高通量篩選系統(tǒng)的不斷發(fā)展和完善，已經(jīng)篩選獲得了一系列的藥物治療耐藥基因或毒物抗性基因[22-24]。FDX1基因編碼一種小鐵硫蛋白，通過鐵氧還蛋白還原酶將電子從NADPH轉(zhuǎn)移到線粒體細胞色素P450，參與類固醇，維生素D和膽汁酸代謝[25]。研究表明，F(xiàn)DX1功能的喪失破壞了鐵-硫成簇酶的活性和細胞中鐵的穩(wěn)態(tài)分布，導致線粒體鐵過載和細胞質(zhì)中的鐵缺失[26]。目前沒有研究表明該分子和NSCLC對奧西替尼耐藥有關。我們敲除了NCI-H1975 細胞對奧西替尼敏感的FDX1，發(fā)現(xiàn)奧西替尼對細胞的增殖能力和克隆形成能力都得到了減弱，表明FDX1 缺失導致NCT-H1975細胞對奧西替尼產(chǎn)生抗性。

利用CRISPR-Cas9文庫篩選發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1缺失表達減弱了伊利司莫（elesclomol）對k562 細胞的毒性作用，而伊利司莫能夠誘導細胞發(fā)生凋亡[27-28]，這提示FDX1 可能參與了奧西替尼對NSCLC 細胞NCI-H1975 的凋亡誘導功能。目前的研究已經(jīng)證明，奧西替尼能夠有效地誘導EGFR 突變的NSCLC 細胞發(fā)生凋亡，這種作用可能是通過抑制EGFR以及下游ERK信號通路，導致BIM蛋白的表達上調(diào)和Mcl-1 蛋白的降解來實現(xiàn)的，抑制ERK信號通路能夠增強細胞對奧西替尼的敏感性[29]。另外對奧西替尼產(chǎn)生獲得性抗性的NSCLC細胞的研究發(fā)現(xiàn)，和敏感的細胞相比，NSCLC 抗性細胞對于MEK 信號通路抑制劑司美替尼（selumetinib）的抑制作用更加敏感，而同時使用奧西替尼和司美替尼能夠阻止NSCLC 細胞PC9 耐藥性細胞的發(fā)生，并且能夠延緩NCI-H1975 細胞針對奧西替尼產(chǎn)生耐藥[18]。這些研究提示，MAPK/ERK信號通路的激活可能是導致NSCLC細胞對奧西替尼產(chǎn)生耐藥的分子機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，當敲除FDX1后，能夠明顯減弱奧西替尼誘導NCI-H1975 細胞凋亡作用。信號通路結(jié)果表明，敲除FDX1 后，奧西替尼對NCI-H1975細胞中EGFR 信號通路以及與凋亡有關的ERK 信號通路的抑制作用都均減弱，這可能正是FDX1 在NCI-H1975 細胞中對奧西替尼產(chǎn)生耐藥功能的重要分子機制之一，但是FDX1 是如何調(diào)控相關信號通路活性還需深入研究。