胡慧慧，張 曼

（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院 北京大學第九臨床醫(yī)學院 尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室，北京100038）

轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，分子量55kDa，以同源四聚物的形式存在，四聚物分子量14kDa。TTR在人類肝臟、脈絡叢與小腸合成，首先在人類腦脊液與血清中被發(fā)現(xiàn)，在人體內轉運甲狀腺素，同時與視黃醇結合蛋白（retind protein，RBP）結合轉運視黃醇與維生素A［1］。所有物種在生長發(fā)育的整個階段肝內一直合成TTR，同時伴隨血清中蛋白水平的升高。對于肝內甲狀腺素合成保持的原因有兩種解釋，解釋一是關于肝臟TTR基因合成的保持與體質量比率中脂質池的增加相一致，另一種解釋是成年體內肝臟TTR的合成與體溫恒定相關聯(lián)。以上說明，TTR對維持人體正常生理功能發(fā)揮重要作用。目前，關于TTR與結直腸癌的報道已成為一個熱點。結直腸癌患者的血清與正常人、結直腸息肉患者血清相比，TTR的表達是下調的。而正常人與結直腸息肉之間的TTR的表達卻沒有差異。因此，TTR可以在結直腸癌中發(fā)揮腫瘤標志物的作用［2］。并且在結直腸癌發(fā)生淋巴結轉移與未發(fā)生淋巴結轉移的患者血清中，TTR存在差異表達。在發(fā)生淋巴結轉移的結直腸癌患者血清中，TTR的表達是下調的［3］。我們曾報道，發(fā)生遠處轉移的結直腸癌患者血清，與未發(fā)生遠處轉移的患者血清相比，TTR的表達同樣是下調的?？梢缘贸鼋Y論，TTR與人類結直腸癌的惡性度存在相關性。而TTR與結直腸腫瘤患者不同分期之間的相關性沒有相關報道。本實驗收集12例正常人，12例結直腸息肉與47例結直腸惡性腫瘤患者血清，利用Westernblot的方法檢測TTR是否存在差異表達。

材料和方法

1 研究對象

收集12例正常對照，12例結直腸息肉，47例結直腸惡性腫瘤患者的血清。所有受試者信息均按年齡、性別、分期，詳細信息見表1。研究對象均排除其他惡性腫瘤、血液系統(tǒng)、甲狀腺疾病、急慢性感染等其他疾病。本研究的開展經醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 入組患者信息表

2 方法

Western blot：血清樣本總蛋白濃度經定量后，2×Loading buffer（鼎國昌盛，中國）與含60μg總蛋白體積的血清1∶1混勻，進行SDS-PAGE，其中電泳濃縮膠電壓60V，分離膠120V。半干電轉儀轉膜25V，90min，封閉液封閉90min（封閉液PBST+5%脫脂奶粉）。雜交一抗，其中TTR（Abcam，USA）比例1∶1000，β-actin（Santa Cruz）1∶400，稀釋劑為封閉液，4℃過夜。PBST（PBS+0.05% Tween）洗膜三次，每次20min。雜交二抗（Dingguo，China），室溫搖床孵育90 min，PBST洗膜三次，每次15min，DAB顯色液對膜進行顯色5min。Image J分析軟件對條帶光密度進行鑒定。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS22.0進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差表示，組間比較使用方差分析法。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TTR在正常人、結直腸息肉及結直腸癌患者血清中的表達

在血清中，TTR在結直腸惡性腫瘤中的表達下調。TTR在正常組、息肉組與癌癥組的灰度比值分別為15.81±4.38、15.37±3.04、7.61±3.44。在正常人與結直腸惡性腫瘤，結直腸息肉與結直腸惡性腫瘤患者中，TTR的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，P＜0.001）。

圖1 TTR在12例正常人（C1-C12）血清中的表達

圖2 TTR在12例結直腸息肉患者（P1-P12）血清中的表達

圖3 TTR在12例結直腸腫瘤患者（T1-T12）血清中的表達

圖4 TTR在正常人、息肉及結直腸癌患者表達統(tǒng)計分析

2 TTR在不同分期結直腸癌患者血清樣本中的表達

TTR與患者的年齡、性別沒有相關性（P＞0.05）。TTR在pT1、pT2、pT3及pT4組的灰度比值分別為8.61±2.95、7.17±1.15、6.39±1.89、4.78±0.95。TTR在pT1（I期）與pT4（IV期）樣本中的表達具有差異（P＝0.004），在pT4期中，TTR呈低表達狀態(tài)。其他組別之間的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 TTR在不同分期腫瘤患者表達的統(tǒng)計分析

討 論

TTR結合的配體十分多樣化，這就決定了TTR在人體發(fā)揮的功能具有多樣性。這些配體分為兩類：“天然配體”與“合成配體”?！疤烊慌潴w”包括 甲狀腺素（T3與T4）與視黃醇，“合成配體”包括非類固醇抗炎藥物，多氯雙酚化合物與阻燃物［1］。CHANG等［4］報道TTR的N末端與配體的結合緊密性相關。短而多的親水性N末端與T4更加緊密的結合。因為TTR的C末端與TTR結合中心“通道”，所以C末端的片段可能影響TTR與THs結合的親和力［5］。TTR結合配體的多樣化決定了其在體內發(fā)揮功能的多樣化，尤其與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系。

目前關于TTR與消化道腫瘤的報道。TTR在消化道腫瘤組織中大部分成低表達狀態(tài)。LIU等［6］研究在膽管上皮細胞癌患者血清中，TTR的表達水平顯著下調。在臨床膽管上皮細胞癌的診斷中TTR可以作為CA19-9的輔助標志物作用。在胰腺癌相關性的研究中，TTR在胰腺癌患者血清中表達上調，與慢性胰腺炎與膽總管結石患者相比，上調幅度可以達到2倍。TTR在胃癌相關性研究中，通常被作為評價營養(yǎng)狀態(tài)的一個指標［7］。LIU等［8］報道在胃癌術后營養(yǎng)支持的患者中，根據營養(yǎng)狀態(tài)的不同分為三大組，腸內營養(yǎng)、腸外營養(yǎng)及混合營養(yǎng)，研究結果表明TTR在混合營養(yǎng)中的水平遠遠高于腸內營養(yǎng)及腸外營養(yǎng)組，而腸內外混合營養(yǎng)胃癌患者的術后最好。同樣在食管癌合并糖尿病的患者群體中，TTR同樣可以發(fā)揮營養(yǎng)狀態(tài)指標的作用。

MOORE等［9］報道，在卵巢癌高發(fā)人群中，在CA125＞35U/mL時，TTR聯(lián)合APOA1檢測可以提高卵巢癌的診斷的特異性及靈敏度。BEATE等［10］報道TTR由卵巢癌組織修飾后分泌，血清與腹水中TTR的表達存在差異，腹水TTR的表達可以反映血管對TTR的過濾情況。在宮頸癌與TTR相關性研究中，TTR在癌癥中同樣表達下調，在與CA125相比，TTR在pT2與pT3分期腫瘤中的靈敏度與特異性十分低。LIU等［8］研究在膽管上皮細胞癌患者血清中，TTR的表達水平顯著下調。在臨床膽管上皮細胞癌的診斷中TTR可以作為CA19-9的輔助標志物作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在血清中，TTR在與結直腸腫瘤的分期具有相關性，我們之前的研究曾證實，TTR與結直腸惡性腫瘤是否轉移存在相關性，在發(fā)生遠處轉移患者的血清里，TTR的表達要低于未發(fā)生遠處轉移患者組［11］。在血清中，與正常人與結直腸息肉患者相比，TTR在結直腸惡性腫瘤中的表達下調。TTR在pT1（I期）與pT4（IV期）樣本中的表達具有差異，在pT4期中，TTR呈低表達狀態(tài)。以上結果說明，TTR的表達與結直腸腫瘤的惡性度存在相關性，TTR在結直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TTR可以為結直腸腫瘤的診斷及診療發(fā)揮腫瘤標志物的作用。

綜上研究，TTR與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤、遠處轉移均有不同程度相關，這可為臨床上腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供新靶向。但許多作用機制尚不明了，如為何TTR在不同腫瘤組織中表達差異；TTR與致癌基因、抑癌基因、信號傳導、細胞增殖和凋亡的關系。這些問題都有待進一步研究，以充分闡明其作用機制，判斷TTR在腫瘤診斷與治療方面的價值。