程 杰, 王 鵬, 關(guān)勝江, 趙 建, 張春旭, 趙 倩, 張裕翔

(河北省中醫(yī)院,河北 石家莊050000)

腰椎間盤突出癥是當(dāng)今社會常見病、多發(fā)病,也是引起腰腿痛最常見的原因,其臨床癥狀大多因腰椎間盤退變、纖維環(huán)破裂、髓核向后方突出或突至椎板內(nèi),致使相鄰組織受刺激或壓迫而出現(xiàn),以L4-5、L5-S1間隙發(fā)病率最高［1］。腰椎間盤突出癥急性期疼痛劇烈,腰椎功能嚴(yán)重受限,極大影響了患者生存質(zhì)量,如果治療不當(dāng)轉(zhuǎn)為慢性,則病情反復(fù)發(fā)作,遷延難愈。

該疾病屬于中醫(yī)“腰腿痛” “痹證” 范疇［2］。通陽利濕方是河北省中醫(yī)院名中醫(yī)趙建教授在多年臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)上確定的方劑,由黃芪、桂枝、木瓜、蠶沙、白芍、白術(shù)、茯苓等成,具有補(bǔ)陽通脈、運(yùn)化水濕功效,在臨床使用多年,療效顯著,但作用機(jī)制不明。因此,本實驗從抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成角度考察通陽利濕方對腰椎間盤突出模型大鼠的影響,以期為治療該疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 通陽利濕方由黃芪、桂枝、木瓜、蠶沙、白芍、白術(shù)、茯苓、青風(fēng)藤、澤瀉、苦杏仁、絲瓜絡(luò)、漢防己、桑枝、薏苡仁、狗脊、懷牛膝、路路通、酒大黃、獨(dú)活、姜黃、威靈仙組成,藥材購自河北省中醫(yī)院,經(jīng)國藥樂仁堂石家莊藥材有限公司專家鑒定為正品,制備方法為頭煎加800 mL 水,煎至300 mL 濾出,然后加500 mL 水煎至300 mL,濾出,兩煎相兌后濃縮到最濃。陽性藥為腰痛寧膠囊(頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司,生產(chǎn)批號620153,0.3 g/粒),內(nèi)容物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解,配制0.02 g/mL 混懸液。注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,生產(chǎn)批號16121205-1),160 萬單位/支。

1.2 動物 SPF 級雄性SD 大鼠70 只,體質(zhì)量180～200 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物使用許可證號SYXK(冀)2013-1-003,動物合格證號1705188,飼養(yǎng)于實驗動物屏障系統(tǒng)中,自由進(jìn)食滅菌鼠糧和攝取重蒸水,人工照明(12 h 黑暗/12 h 光照),保持溫度20～25 ℃,濕度(55±5)%。

1.3 試劑 腫瘤壞死因子(TNF-α) (批號C06PZB)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β) (批號C09PDB)、白細(xì)胞介素6(IL-6) (批號C12PDB) 試劑盒均購自于北京北方生物技術(shù)研究所；RT-PCR 試劑盒購自寶生物工程(大連) 有限公司；Trizol 購自美國Invitroge 公司。PCR 引物序列為成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2) 正向5′-CGAACCGGTACCTGGCTATG-3′,反 向5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT-3′, 預(yù) 擴(kuò) 增 片 段162 bp；基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) 正向5′-AGCAAGTAGACGCTGCCTTT-3′, 反 向 5′-CAGCACCTTTCTTTGGGC AC-3′,預(yù)擴(kuò)增片段469 bp；GAPDH 正 向5′-AGGAAATGATGACCTCCTGAACT-3′,反向5′-CAGGCATTGTCTGAGAG GCA-3′,預(yù)擴(kuò)增片段605 bp。

1.4 儀器 756MC 型紫外-可見分光光度計,購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；PE9600 型PCR 擴(kuò)增儀,購自美國PE 公司；電泳儀、電泳槽,購自北京六一儀器廠；MDF-382E 超低溫保存箱,購自日本SANYO 公司；1-15K 高速冷凍離心機(jī),購自美國Sigma 公司；ASB240 生物信號采集系統(tǒng),購自重慶生物科技技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 模型制備［3］大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,俯臥位固定,距肛門1 cm 處扎緊尾部,將結(jié)扎處遠(yuǎn)心端的尾部切下,壓迫止血并縫合,將尾椎關(guān)節(jié)椎間盤組織中乳白色膠凍樣髓核組織取出,合并后備用,背部手術(shù)區(qū)碘伏消毒,備皮,切開皮膚(長約3 cm),從左側(cè)棘突上將L5,6段腰椎鈍性分離,暴露橫突,咬除橫突及其附帶的椎板,切除左側(cè)部分L5,6段的椎板和上下關(guān)節(jié)突,將大鼠自體尾椎髓核組織(約10 mg) 植入左側(cè)L5神經(jīng)根出硬膜囊的交界處,對于神經(jīng)根及硬膜囊不造成壓迫,逐層縫合組織；假手術(shù)組大鼠除不植入髓核外,其余操作同模型大鼠。造模完成后,各組大鼠每天肌肉注射青霉素鈉(1.6 萬單位)1 次,連續(xù)3 d。

2.2 分組與給藥 將造模成功的大鼠按照初始痛閾值隨機(jī)分為5 組,分別為模型組、腰痛寧膠囊組(混懸液0.2 g/kg,根據(jù)不同動物等效劑量的折算系數(shù)表計算,相當(dāng)于臨床等效劑量)、通陽利濕方組(60、30、15 g/kg) (依據(jù)課題組前期預(yù)實驗,進(jìn)行劑量探索而定),每組10 只,另設(shè)假手術(shù)組大鼠10 只。造模成功3 d 后,各組大鼠按照10 mL/kg 劑量灌胃給藥(或蒸餾水),連續(xù)30 d。

2.3 指標(biāo)測定

2.3.1 機(jī)械壓痛痛閾值 初次給藥前和末次給藥后1 h,將各組大鼠放入固定器內(nèi),左后肢暴露于外,待其安靜后將左后肢置于壓痛儀上測定痛閾值。

2.3.2 血清TNF-α,IL-1β、IL-6 水平 末次給藥后,各組大鼠禁食12 h,腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,30 min 內(nèi)分離血清,ELISA 法測定血清中TNF-α,IL-1β 及IL-6 水平。

2.3.3 椎間盤組織FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá) 采用RTPCR 法。分離、剝?nèi)〈笫笱甸g盤組織,置于-80 ℃冰箱保存,取大鼠椎間盤組織100 mg 左右,置于勻漿器中,加適量RNAiso Plus,勻漿器勻漿后提取總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。FGF-2 擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性40 s,54 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,共30 個循環(huán),72 ℃延伸10 min；MMP-2 擴(kuò)增條件為52 ℃退火50 s,其余同F(xiàn)GF-2；GAPDH 擴(kuò)增條件為55 ℃退火50 s,其余同F(xiàn)GF-2。取每個標(biāo)本PCR 產(chǎn)物各6 μL,在含1%GV 核酸染料的瓊脂糖凝膠中電泳,以DNA Marker(DL2000) 為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記,電泳后以紫外透射儀觀察并拍照,采用Quantity One 圖像分析系統(tǒng)分別檢測各組FGF-2、MMP-2、GAPDH 電泳條帶灰度值,將兩者與GAPDH比值為mRNA 相對表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 通陽利濕方對大鼠機(jī)械壓痛痛閾值的影響 表1 顯示,模型組、腰痛寧膠囊組、通陽利濕方組大鼠初始痛閾值均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05,P＜0.01),而模型組大鼠最終痛閾值顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)；與模型組比較,通陽利濕方組大鼠最終痛閾值顯著升高(P＜0.05),并且60、30 g/kg 組痛閾增加值顯著增加(P＜0.05,P＜0.01),但15 g/kg 組無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 通陽利濕方對大鼠機(jī)械壓痛痛閾值的影響（n=10）

表1 通陽利濕方對大鼠機(jī)械壓痛痛閾值的影響（n=10）

注：與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與假手術(shù)組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1) 初始痛閾值/g 最終痛閾值/g 痛閾增加值/g假手術(shù)組 — 345.1±111.2** 468.9±91.8** 123.3±103.7模型組 — 214.0±65.2＃＃ 272.5±81.6＃＃ 58.5±21.3腰痛寧膠囊組 0.2 240.9±61.1＃＃ 421.8±149.5** 180.9±108.3**通陽利濕方組 60 247.4±79.1＃＃ 405.0±139.0* 157.6±79.2**通陽利濕方組 30 266.8±76.4＃ 394.9±120.7* 128.1±63.0*通陽利濕方組 15 268.3±72.7＃ 391.2±100.2* 122.9±54.2

3.2 通陽利濕方對TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響 表2顯示,模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均較假手術(shù)組顯著升高 (P ＜0.01)。 與模型組比較, 通陽利濕方 (60、30 g/kg) 組TNF-α、IL-1β 水平顯著降低(P＜0.05),但15 g/kg 組無顯著差異(P＞0.05)；通陽利濕方(60 g/kg)組IL-6 水平顯著降低(P＜0.05),而30、15 g/kg組雖無顯著差異(P＞0.05),但也呈現(xiàn)降低趨勢。

表2 通陽利濕方對TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響n=10）

表2 通陽利濕方對TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響n=10）

注：與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1) TNF-α/(ng·mL-1) IL-1β/(ng·mL-1) IL-6/(pg·mL-1)假手術(shù)組 — 0.85±0.35** 0.17±0.02** 87.8±23.2**模型組 — 1.29±0.16 0.32±0.10 134.2±40.8腰痛寧膠囊組 0.2 1.02±0.23* 0.21±0.07** 98.8±40.1*通陽利濕方組 60 1.05±0.20* 0.22±0.05* 101.9±34.0*通陽利濕方組 30 1.06±0.28* 0.24±0.11* 108.3±30.7通陽利濕方組 15 1.25±0.15 0.25±0.11 113.9±29.8

3.3 通陽利濕方對FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá)的影響 表3、圖1 顯示,模型組FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,通陽利濕方組兩者mRNA 表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。

表3 通陽利濕方對FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá)的影響n=10）

表3 通陽利濕方對FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá)的影響n=10）

注：與模型組比較,**P＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1) FGF-2 MMP-2假手術(shù)組 — 0.264±0.016** 0.251±0.136**模型組 — 0.638±0.019 0.630±0.025腰痛寧膠囊組 0.2 0.376±0.027** 0.311±0.053**通陽利濕方組 60 0.379±0.056** 0.389±0.055**通陽利濕方組 30 0.444±0.020** 0.394±0.018**通陽利濕方組 15 0.554±0.026** 0.538±0.013**

圖1 各組FGF-2、MMP-2 mRNA 表達(dá)

4 討論

隨著我國進(jìn)入到老齡化社會的進(jìn)程,腰椎間盤突出癥已經(jīng)成為臨床常見病和多發(fā)病,主要表現(xiàn)為反復(fù)腰痛和坐骨神經(jīng)痛,對患者工作和生活影響極大。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道腰椎間盤突出癥在急性期時,西醫(yī)大多以20%甘露醇、甘油、果糖等進(jìn)行治療,此類滲透性脫水劑靜脈滴注后能迅速提高血漿滲透壓,使組織水分向血漿轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生脫水作用,該療法效果雖好,但多次輸注可引起部分患者靜脈受損,加重組織損傷,局部出現(xiàn)皮膚發(fā)紅、腫脹、疼痛,致血栓性靜脈炎等發(fā)生,甚至引起無菌性炎癥、壞死、潰爛,這些不良反應(yīng)限制了其應(yīng)用時間,而且患者耐受性差。

中醫(yī)并無腰椎間盤突出癥,該病屬“腰腿痛” “痹證”范疇,一般分為寒濕型、濕熱型、血瘀型、肝腎虧虛型等,對其大多采用活血化瘀、補(bǔ)益肝腎的治法,起效較慢。河北省中醫(yī)藥名老中醫(yī)趙建教授受西醫(yī)脫水劑治療腰椎間盤突出癥療效理想的啟發(fā),通過大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)急性期患者大多有濕邪留滯經(jīng)絡(luò)、阻遏陽氣調(diào)達(dá)的表現(xiàn),據(jù)此確立了一個新的證型——濕阻陽遏型,并提出治療法則——通陽利濕法,以融解滯澀于腰部經(jīng)絡(luò)的水濕,以及水濕日久所化的瘀滯之邪,通行陽氣以四部條達(dá),自擬通陽利濕方。方中君藥黃芪、桂枝、狗脊,補(bǔ)陽通脈；白芍、白術(shù)、茯苓、澤瀉為臣藥,其中白芍與桂枝合《傷寒論》 桂枝湯之意,疏解太陽經(jīng)之痹,太陽融雪；茯苓、豬苓、白術(shù)、澤瀉與桂枝共用,暗合五苓散、苓桂術(shù)甘湯方義,健運(yùn)脾陽使水濕得以運(yùn)化,溫煦腎陽來氣化陰邪；苦杏仁、粉防己、白芍、薏苡仁亦為臣藥,意在調(diào)臟腑之氣,其中苦杏仁提壺揭蓋,宣啟肺之上源,粉防己肅泄肺之雍閉,薏苡仁淡滲中焦之濕,白芍暢肝解郁；酒軍為佐,制約黃芪、桂枝、狗脊、威靈仙之熱性；通經(jīng)之藥蠶沙、桑枝、絲瓜絡(luò)、青風(fēng)藤、路路通為佐,通利經(jīng)絡(luò)之風(fēng)寒濕之痹邪；獨(dú)活、威靈仙、懷牛膝、木瓜為使,是為引經(jīng),其中獨(dú)活善入膀肌經(jīng)下部,威靈仙通行十二經(jīng), “牛膝行到膝,木瓜行到底”,引方中諸藥以達(dá)病所,以上諸藥合用,能通達(dá)四臟一腑之陽氣,利行滯澀之濕瘀,共奏通陽利濕之功。

前期課題組已證實,通陽利濕方對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)有良好的鎮(zhèn)痛作用,對大鼠棉球肉芽腫也有抑制作用。本實驗采用大鼠自身尾椎髓核移植入腰椎神經(jīng)根復(fù)制腰椎間盤突出癥模型,并檢測大鼠左后肢機(jī)械壓痛痛閾值,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠痛閾值明顯低于假手術(shù)組,證實髓核突出可引起大鼠痛敏感反應(yīng),與文獻(xiàn)［4］ 報道一致；給予通陽利濕方后,大鼠左后肢機(jī)械壓痛痛閾值明顯增加,表明該方對痛敏感有良好的改善作用。

關(guān)于引起腰椎間盤突出癥痛覺過敏的原因眾說紛紜,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為與髓核機(jī)械壓迫有關(guān)［5］；也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),髓核引起自身免疫反應(yīng)所致的神經(jīng)根炎癥是引起神經(jīng)根癥狀的主要原因［6］；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為,椎間盤組織突出區(qū)域的細(xì)胞能合成和分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 等多種炎性介質(zhì),均與退變程度密切相關(guān)［7］,其中高水平TNF-α 可促進(jìn)I 型膠原合成的增加,并逐步取代II 型膠原而進(jìn)一步發(fā)展成椎間盤纖維化［8］,而大量分泌的TNF-α 又通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、IL-6 等來加速了骨吸收,促進(jìn)了破骨細(xì)胞的增殖和分化,進(jìn)而引起骨量減少,骨組織結(jié)構(gòu)退變,通過破壞骨質(zhì)促進(jìn)腰椎間盤退變［7］,此外TNF-α、IL-1β 還能促進(jìn)PGE2等致痛介質(zhì)釋放,對神經(jīng)根有直接刺激作用,并能增強(qiáng)其對緩激肽的敏感性,故與LDH 的疼痛密切相關(guān)［5,9］；臨床研究也證實,腰椎間盤突出癥患者椎間盤組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)顯著增加［10］,髓核組織的炎性細(xì)胞浸潤時TNF-α 和IL-1β 大量分泌,會引起MMPs 分泌增加［11］。

炎癥反應(yīng)主要通過激活蛋白激酶來引起細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)蛋白成分水解,造成細(xì)胞外基質(zhì)降解,而髓核組織中細(xì)胞外基質(zhì)最主要的成分為多種類型的膠原。MMP-2 能水解Ⅳ型和Ⅴ型膠原,進(jìn)而造成髓核發(fā)生退行性病變［12-13］,臨床研究顯示腰椎間盤突出癥患者椎間盤組織中其蛋白量明顯高于對照組,證實該疾病發(fā)生與MMP-2 水平增高,并引起細(xì)胞外基質(zhì)丟失有關(guān)［14］。在椎間盤退變過程中,可代償性地引起軟骨組織增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,表現(xiàn)為組織中FGF-2 及其受體mRNA 表達(dá)明顯增加［15］。鑒于此,本實驗主要通過分析炎癥因子水平及MMP-2、FGF-2 mRNA 表達(dá),探究通陽利濕方改善腰椎間盤突出癥的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)該方能明顯降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平,下調(diào)組織MMP-2、FGF-2 mRNA 表達(dá),推測可能與抑制炎癥因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成有關(guān)。