趙甜甜, 李小芳, 馬祖兵, 孫 強(qiáng), 劉羅娜, 仲 粒

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,四川 成都611137)

黃芩總黃酮是從唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 干燥根中分離得到的成分,主要包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素,具有多種藥理活性,如解熱抗炎、抗氧化、保肝、抗病毒、抗腫瘤［1］等,臨床上廣泛應(yīng)用于病毒性肝炎、肺炎、腸炎、上呼吸道感染等疾病的治療［2］。但其水溶性較差,生物利用度低［3］,影響了臨床廣泛應(yīng)用。

納米混懸劑有著制備簡(jiǎn)單、輔料用量少等優(yōu)勢(shì),已廣泛應(yīng)用于難溶性藥物增溶研究中,故本實(shí)驗(yàn)將制備黃芩總黃酮納米混懸劑凍干粉。另外,同一化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物由于制備工藝的影響,其晶型會(huì)發(fā)生改變［4］,從而在穩(wěn)定性、溶出度、生物利用度方面存在差異［5］,故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)差示掃描量熱(DSC)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、X 射線粉末衍射(XRD) 對(duì)納米混懸劑凍干粉進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,并考察輔料對(duì)其粉體學(xué)性質(zhì)和吸濕性的影響,以期為黃芩總黃酮相關(guān)制劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

Nicomp 380ZLS 型激光粒度儀(美國(guó)PSS 粒度儀公司)；AH-100D 型高壓均質(zhì)機(jī)(加拿大ATS 公司)；Nicolet 6700 型傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；HSC-1 型差示掃描量熱儀(北京恒久科學(xué)儀器廠)；Mini Fiex 600 型X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司)；UV-6000 型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；SJIA-10N-50 型冷凍干燥機(jī)(寧波市雙嘉儀器有限公司)；ZRS-8G型智能溶出試驗(yàn)儀 (天津市天大天發(fā)科技有限公司)。

黃芩總黃酮原料藥(西安小草植物科技有限責(zé)任公司, 批號(hào)XC20180112, 總黃酮含有量85%)；黃芩苷對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-14083014,含有量98%)。泊洛沙姆188(德國(guó)巴斯夫公司,批號(hào)WPAK539B)；聚乙二醇400、甘露醇、羧甲基淀粉鈉、糊精、滑石粉、可溶性淀粉、微晶纖維素均為分析純,購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.9 mg于100 mL 量瓶中,無(wú)水乙醇超聲溶解并定容,搖勻,制得109.0 μg/mL 溶液,無(wú)水乙醇稀釋成8.72、 9.81、 10.9、 11.99、 13.08 μg/mL,以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照,在277.0 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以黃芩苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(A) 進(jìn)行回歸,得方程為A ＝0.053X+0.06(R2＝0.999 7),在8.72 ～13.08 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 納米混懸液制備 采用沉淀-高壓均質(zhì)法。取黃芩總黃酮0.51 g,加入10 mL 無(wú)水乙醇,室溫下超聲溶解, 作為有機(jī)相； 取穩(wěn)定劑 (P188 ∶PEG400＝1 ∶1) 0.52 g,溶于100 mL 純水中,作為水相,持續(xù)攪拌水相至無(wú)氣泡時(shí),將有機(jī)相勻速注入水相中,700 r/min 下持拌15 min,55 ℃水浴中旋蒸除盡乙醇,得到粗混懸液。然后,將上述混懸液轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機(jī)中,先于50 MPa 下預(yù)均質(zhì)循環(huán)2 次,再于100 MPa 下均質(zhì)循環(huán)16 次,即得。

2.3 納米混懸劑凍干粉制備 取“2.2” 項(xiàng)下納米混懸劑,加入4%甘露醇后分裝于西林瓶中,采用慢凍方式,經(jīng)3 ℃ (2 h) 預(yù)冷、-18 ℃(12 h)、-70 ℃ (12 h) 分步預(yù)凍后減壓干燥48 h,即得。

2.4 物理混合物制備 依次稱取黃芩總黃酮0.51 g、P188 260 mg、PEG-400 260 mg,純水混勻,加入4%甘露醇,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.5 空白輔料制備 依次稱取P188 260 mg、PEG-400 260 mg,純水混勻,加入4%甘露醇,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.6 體外溶出度測(cè)定 取納米混懸劑凍干粉、物理混合物適量(各含黃芩總黃酮10 mg),按2015年版《中國(guó)藥典》 四部0931 第二法(槳法) 測(cè)定溶出度,介質(zhì)900 mL 超純水,溫度(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速100 r/min。從藥物粉末與溶出介質(zhì)液面接觸時(shí)開 始 計(jì) 時(shí), 分 別 于5、 10、 20、 30、 40、 50、60 min各取樣5 mL(同時(shí)補(bǔ)加5 mL 等溫介質(zhì)超純水),0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,計(jì)算溶出率,結(jié)果見圖1。由圖可知,納米混懸劑凍干粉在60 min 內(nèi)的溶出度達(dá)到88.4%,而物理混合物僅為28.7%。

圖1 樣品溶出曲線Fig.1 Dissolution curves for samples

2.7 理化性質(zhì)研究

2.7.1 差示掃描量熱(DSC) 分析 取空白輔料、黃芩總黃酮、納米混懸劑凍干粉、物理混合物適量,進(jìn)行DSC 分析,條件為升溫速率10 ℃/min,掃描范圍30～350 ℃,結(jié)果見圖2。由圖可知,空白輔料在154.31 ℃處有特征吸熱峰；黃芩總黃酮在225.94 ℃處有明顯吸熱峰； 物理混合物在155.93 ℃處有輔料吸熱峰,黃芩總黃酮特征峰向低溫方向發(fā)生了移動(dòng),可能是輔料和藥物熔融時(shí)互相 影 響 造 成 的［6］； 納 米 混 懸 劑 凍 干 粉 僅 在153.37 ℃處有輔料吸熱峰,而黃芩總黃酮特征峰消失,表明藥物可能以無(wú)定形狀態(tài)均勻分散在載體中。

圖2 樣品DSC 曲線Fig.2 DSC curves for samples

2.7.2 X 射線衍射(XRD) 分析 取空白輔料、黃芩總黃酮、納米混懸劑凍干粉、物理混合物適量,進(jìn)行XRD 分析,條件為Cu 靶,K 線,電壓40 kV,步長(zhǎng)0.02°,掃描范圍5°～90°,結(jié)果見圖3。 由 圖 可 知, 黃 芩 總 黃 酮 在9.06°、 10.44°、12.50°、14.75°、17.07°、23.85°、28.03°處有明顯的衍射峰,具有完整的晶型狀態(tài)；物理混合物中藥物晶體衍射峰強(qiáng)度有所減弱,并稍移動(dòng),可能是輔料和藥物在簡(jiǎn)單的攪拌混合過(guò)程中發(fā)生了較弱的相互作用,但依然能清晰分辨出藥物特征衍射峰,即在載體中的晶型并未發(fā)生改變；納米混懸劑凍干粉中藥物特征衍射峰消失,其結(jié)構(gòu)由晶體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形狀態(tài)［7］。

圖3 樣品XRD 圖Fig.3 XRD patterns for samples

2.7.3 傅里葉紅外變換(FT-IR) 分析 取空白輔料、黃芩總黃酮、納米混懸劑凍干粉、物理混合物適量,采用KBr 壓片法,在4 000～400 cm-1處掃描,進(jìn)行FT-IR 分析,結(jié)果見圖4。由圖可知,黃芩總黃酮分別在3 550.36、1 726.69、1 660.01 cm-1處有-OH、C ＝O、 C ＝C 伸 縮 振 動(dòng) 峰, 在1 301.15、1 200.73 cm-1處分別為苯環(huán)骨架上的C-H 彎曲振動(dòng)、C＝C 伸縮振動(dòng)特征峰,在1 252.00、1 065.84 cm-1處出現(xiàn) C-O-C 伸縮振動(dòng)峰； 空白輔料在1 197.02 cm-1處的吸收峰對(duì)物理混合物造成干擾,導(dǎo)致其苯環(huán)骨架上的C ＝C 伸縮振動(dòng)特征峰消失,但藥物其他幾個(gè)特征峰依然存在；納米混懸劑凍干粉吸收峰與物理混合物相似,即藥物與載體之間無(wú)相互作用。

圖4 樣品FT-IR 光譜圖Fig.4 FT-IR spectra for samples

2.8 輔料對(duì)粉體學(xué)基本性質(zhì)的影響

2.8.1 休止角 采用固定圓錐法測(cè)定。將玻璃漏斗固定在鐵架臺(tái)上,漏斗下端距離水平桌面高為H,取凍干粉、凍干粉與輔料混合粉(2 ∶1) 適量,使藥粉從漏斗上面均勻流下,直到圓錐體頂點(diǎn)與漏斗下端接觸為止,測(cè)量圓錐體直徑2R,平行3次,取平均值,再計(jì)算休止角θ,公式為θ ＝arctg(H/R)。結(jié)果見表1。

2.8.2 堆密度 取已稱重的10 mL 量筒,質(zhì)量記為m,用漏斗將適量?jī)龈煞邸龈煞叟c輔料混合粉(2 ∶1) 勻速注入量筒中,精密稱定質(zhì)量,記為M,同時(shí)記錄粉末體積V1,平行3 次,取平均值,計(jì)算堆密度ρ1,公式為ρ1＝ (M-m) /V1。結(jié)果見表1。

2.8.3 振實(shí)密度 將“2.8.2” 項(xiàng)下裝有一定體積藥粉的量筒從距離水平桌面大概2 cm 處自由下落,重復(fù)15 次,記錄粉末體積V2,計(jì)算堆密度ρ2,公式為ρ2＝ (M-m) /V2。結(jié)果見表1。

2.8.4 溶出度 取適量?jī)龈煞叟c輔料混合粉(2 ∶1),按“2.6” 項(xiàng)下方法測(cè)定溶出度。結(jié)果見表1。

表1 5 種輔料對(duì)納米混懸劑凍干粉粉體學(xué)性質(zhì)的影響（n=3）Tab.1 Effects of five excipients on the powder properties of nanosuspension lyophilized powder（n=3）

2.8.5 結(jié)果分析 一般情況下,θ＜30°表明流動(dòng)性良好,＞45°表明流動(dòng)性較差［8］。由表1 可知,納米混懸劑凍干粉的休止角約為42.30°,流動(dòng)性較差；加入滑石粉、糊精后有所減小,表明兩者可改善其流動(dòng)性；加入糊精后堆密度和振實(shí)密度最大,表明該混合粉蓬松,有利于填充,而且粒子之間的黏附力和摩擦力最小, 有利于粉體流動(dòng)和堆積［9-10］；溶出度無(wú)明顯變化,表明輔料不影響藥物溶出。

2.9 輔料對(duì)吸濕性的影響

2.9.1 吸濕率 配制氯化鈉過(guò)飽和溶液(相對(duì)濕度75%) 于干燥器中,25 ℃下飽和24 h。稱取納米混懸劑凍干粉、凍干粉與輔料(2 ∶1) 混合粉各0.3 g,混合均勻后置于干燥器內(nèi)恒重48 h,平鋪在已飽和的具塞稱量瓶(敞口) 中,精密稱定質(zhì)量后置于干燥器中,于第0、1、2、3、4、6、8、10 天取樣稱重,計(jì)算吸濕率,公式為吸濕率＝［(吸濕后樣品質(zhì)量-吸濕前樣品質(zhì)量) /吸濕前樣品質(zhì)量］ ×100%,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸濕率為縱坐標(biāo)繪制吸濕曲線,見圖5。由圖可知,不同輔料對(duì)納米混懸劑凍干粉吸濕性的影響不同,其中羧甲基淀粉鈉可加劇吸濕過(guò)程,可溶性淀粉與微晶纖維素的阻濕過(guò)程相近,滑石粉與糊精的阻濕過(guò)程相近,并優(yōu)于前者。

圖5 輔料吸濕曲線Fig.5 Moisture absorption curves for excipients

2.9.2 吸濕方程 由于吸濕加速度越小,平衡吸濕率、樣品吸濕能力越低［11］,故本實(shí)驗(yàn)以吸濕加速度和平衡吸濕率為指標(biāo),考察輔料對(duì)納米混懸劑凍干粉吸濕性的影響。根據(jù)“2.9.1”項(xiàng)下測(cè)得吸濕率進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合,得吸濕方程為w ＝at2+bt+c(w 為吸濕率,t 為吸濕時(shí)間,a、b、c 均為常數(shù)),對(duì)其進(jìn)行一階求導(dǎo),得吸濕速率方程為v ＝dw/dt ＝2at+b,再對(duì)其進(jìn)行一階求導(dǎo),得吸濕加速度方程為v′＝dv/dt ＝2a,當(dāng)吸濕速率為0 時(shí)可得到平衡吸濕率,結(jié)果見表2。由表可知,多項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)R2都接近1,表明擬合效果良好,吸濕加速度依次為滑石粉＜糊精＝可溶性淀粉＜微晶纖維素＜凍干粉＜羧甲基淀粉鈉,平衡吸濕率依次為滑石粉＜糊精＜微晶纖維素＜可溶性淀粉＜凍干粉＜羧甲基淀粉鈉,可知羧甲基淀粉鈉的吸濕加速度和平衡吸濕率均較大,而滑石粉兩者均較小,與圖5 一致。

表2 5 種輔料對(duì)納米混懸劑凍干粉吸濕性的影響Tab.2 Effects of five excipients on the hygroscopicity of nanosuspension lyophilized powder

3 討論

納米混懸液是近年來(lái)針對(duì)難溶性藥物開發(fā)的一種新型制劑形式,由于它屬于熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定體系,因此要將其固化［12］,常用的固化技術(shù)有噴霧干燥［13］、 真空干燥［14］、 冷凍干燥［15］等, 本實(shí)驗(yàn)選擇冷凍干燥制備復(fù)水效果較好的黃芩總黃酮納米混懸劑凍干粉。但在干燥過(guò)程中發(fā)現(xiàn),由于凍結(jié)應(yīng)力與低溫應(yīng)力的存在, 會(huì)發(fā)生 “凍干損傷”［16］,導(dǎo)致凍干粉粒徑增大,故開發(fā)安全低毒或藥輔合用的新型凍干保護(hù)劑具有重大意義。

然后,通過(guò)DSC、FT-IR、XRD 對(duì)納米混懸劑凍干粉的理化性質(zhì)進(jìn)行表征。DSC、XRD 顯示,黃芩總黃酮在凍干粉中呈無(wú)定形高度分散,藥物結(jié)晶度與其飽和溶解度呈負(fù)相關(guān)［17］,無(wú)定形納米粒促進(jìn)了藥物溶出；FT-IR 顯示,黃芩總黃酮與載體之間無(wú)相互作用,不影響其藥效發(fā)揮。

納米混懸劑凍干粉作為一種制劑中間體,通常要加入不同輔料制成相應(yīng)制劑,才能應(yīng)用于臨床,同時(shí)它作為粉體,流動(dòng)性好時(shí)有利于減少裝量差異［18］。吳超群等［19］通過(guò)高濕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),納米混懸劑凍干粉分別在相對(duì)濕度75%、92.5%下有吸濕增重、嚴(yán)重結(jié)塊現(xiàn)象,故選擇輔料時(shí)不僅要考慮對(duì)凍干粉粉體學(xué)性質(zhì)的影響,還要關(guān)注其吸濕性。目前,尚無(wú)不同輔料對(duì)納米混懸劑凍干粉性質(zhì)影響的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)選擇常用的5 種輔料(滑石粉、糊精、可溶性淀粉、羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素)對(duì)凍干粉休止角、堆密度、振實(shí)密度、溶出度、吸濕性進(jìn)行研究,可為黃芩總黃酮相關(guān)制劑開發(fā)中輔料篩選提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。