吳 雷，葉樹培，黃玉娥，陳翠儀，陳美華

東莞市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 廣東東莞 523326

支氣管哮喘是一種由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分所介導(dǎo)的具有復(fù)雜免疫機(jī)制的氣道慢性過敏反應(yīng)性疾病[1]。氣道重塑是哮喘的重要特征，也是引起哮喘不可逆氣流阻塞、難治性哮喘和激素抵抗的重要原因之一[2]。平滑肌細(xì)胞異常增殖是氣道重塑的主要機(jī)制[3]。因此，探究氣道重塑過程中平滑肌細(xì)胞異常增殖的分子機(jī)制，對(duì)于哮喘的防治具有重要意義。降鈣素基因相關(guān)肽 (calcitonin gene related peptide，CGRP)是一種新的神經(jīng)肽，其表達(dá)升高可減輕哮喘大鼠氣道炎癥及高反應(yīng)性[4]。受體活性修飾蛋白-1(receptor activity modifying protein-1, RAMP-1)是CGRP家族受體的重要組成部分。既往研究[5]證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞中RAMP-1與CGRP表達(dá)呈正相關(guān)，且RAMP-1過表達(dá)是CGRP抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的主要機(jī)制。RAMP-1在哮喘中的作用目前尚未闡明。因此，本研究以人氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)為研究對(duì)象，將pcDNA3.1-RAMP-1轉(zhuǎn)染ASMCs，旨在探討RAMP-1對(duì)ASMCs增殖和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；pcDNA3.1和pcDNA3.1-RAMP-1購(gòu)自上海索萊寶生物有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；RNase、PI均購(gòu)自江蘇凱基公司；RAMP-1、IκBα、p65NF-κB、PCNA、CyclinD1抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2ASMCs的分離培養(yǎng)采用組織塊貼壁培養(yǎng)法。患者及家屬知情同意后，無菌條件下取東莞市第三人民醫(yī)院肺部良性腫瘤肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉段支氣管標(biāo)本(組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診)。去除周圍結(jié)締組織、軟骨和血管后，預(yù)冷PBS沖洗。轉(zhuǎn)移組織塊至含血清的青霉素小瓶中，將其剪成1 mm3大小組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶底部，加含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，2 h后觀察到組織塊貼壁，翻轉(zhuǎn)瓶底。繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5 d換液1次。胰蛋白酶消化傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)分組取3～8代ASMCs，待細(xì)胞達(dá)60%～70%生長(zhǎng)融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白組(不作轉(zhuǎn)染)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)和pcDNA3.1-RAMP-1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RAMP-1)，每組3孔。轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000試劑盒說明操作。48 h后，Western blot檢測(cè)RAMP-1蛋白轉(zhuǎn)染效果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取3～8代ASMCs，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL。按1.3分組，于轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期取3～8代ASMCs，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，吸棄舊的培養(yǎng)液，加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，過夜，使細(xì)胞同步靜止于G0期。按照1.3分組處理，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，收集于離心管中。離心，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，4 ℃預(yù)冷乙醇輕吹細(xì)胞使之完全重懸，4 ℃固定2 h，離心，收集固定細(xì)胞，PBS洗滌重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，輕輕吹打，加10 μL RNase(10 g/L)，37 ℃水浴10 min，再加入5 μL PI 37 ℃避光水浴染色30 min，過300目篩網(wǎng)。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p65NF-κB、IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，使用適量的裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。配制120 g/L分離膠及50 g/L濃縮膠，按照40 μg/孔上樣蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，洗膜，加入一抗稀釋液(稀釋濃度1∶800)，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液，洗膜，室溫?fù)u床孵育1.0～1.5 h，ECL顯色，曝光，采集圖像，Quantity One軟件分析。以目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析，各組細(xì)胞RAMP-1蛋白表達(dá)，增殖情況，細(xì)胞周期和p65NF-κB、IκBα、PCNA、CyclinD1蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞RAMP-1蛋白的表達(dá)見圖1和表1，pcDNA3.1-RAMP-1組RAMP-1表達(dá)升高。

2.2各組細(xì)胞增殖情況比較結(jié)果見表2。

1～3：分別為空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-RAMP-1組

F=271.702，P<0.001；*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

表2各組細(xì)胞增殖A值比較(n=3)

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.3各組細(xì)胞周期比較結(jié)果見表3。pcDNA3.1-RAMP-1組G0/G1期細(xì)胞比例升高，而S期和G2/M期細(xì)胞比例降低。

表3各組細(xì)胞周期比較

(n=3) %

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.4各組細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路蛋白p65NF-κB、 IκBα、PCNA和CyclinD1的表達(dá)見圖2和表4。pcDNA3.1-RAMP-1組IκBα表達(dá)升高，p65NF-κB、PCNA和CyclinD1表達(dá)均降低。

1～3：分別為空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-RAMP-1組

圖2各組細(xì)胞中p65NF-κB、IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)

表4 各組細(xì)胞中p65NF-κB、 IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的慢性疾病，近些年其發(fā)病率和病死率仍在不斷上升，氣道重塑是哮喘的關(guān)鍵特征之一，平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T輔助細(xì)胞等均參與哮喘的氣道重塑過程[6]。ASMCs是氣道重塑過程中主要的結(jié)構(gòu)成分之一，參與哮喘的病理過程(氣道重塑、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性)[7]?，F(xiàn)有研究[8]發(fā)現(xiàn)，哮喘時(shí)ASMCs數(shù)目增加、體積增大、凋亡減少，氣道壁明顯增厚。因此，抑制哮喘過程中ASMCs增殖對(duì)于哮喘治療有重要意義。

CGRP在體內(nèi)廣泛分布和表達(dá)，具有肺功能保護(hù)、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、心血管系統(tǒng)保護(hù)、骨損傷修復(fù)等多種生物學(xué)活性[9-10]。RAMP-1是CGRP受體之一，是受體調(diào)節(jié)的限速蛋白[11]。有研究[12]顯示，構(gòu)建大鼠RAMP-1基因開放閱讀框的真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，可明顯增強(qiáng)CGRP抑制的血管平滑肌細(xì)胞增殖。CGRP修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖，這可能與CGRP受體表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)CGRP效應(yīng)性有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RAMP-1可明顯抑制ASMCs增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。這與以往研究相符，提示過表達(dá)RAMP-1也可能是哮喘治療的途徑之一。

NF-κB是一個(gè)多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，目前研究[14-15]認(rèn)為，NF-κB信號(hào)通路參與炎癥、免疫反應(yīng)、感染、細(xì)胞凋亡等多種生理和病理過程。NF-κB活化與支氣管哮喘等疾病密切相關(guān)[16]。有研究[17]顯示，增加胞漿IκBα含量，抑制NF-κB表達(dá)和激活，可有效抑制哮喘氣道炎癥；RAMP-1對(duì)可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移，機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[18]。NF-κB信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響與調(diào)節(jié)的下游靶基因有關(guān)。PCNA是一種核內(nèi)蛋白，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞增殖情況，哮喘中氣道平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)水平升高[19]。CyclinD1是一個(gè)細(xì)胞周期蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，主要存在于氣道平滑肌細(xì)胞，在哮喘中表達(dá)水平升高[20]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)RAMP-1可上調(diào)ASMCs中IκBα蛋白的表達(dá)，下調(diào)p65NF-κB、PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)，提示RAMP-1對(duì)ASMCs生長(zhǎng)的影響與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，過表達(dá)RAMP-1可抑制ASMCs增殖，阻滯細(xì)胞周期，機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。RAMP-1可能是哮喘治療的有效干預(yù)靶點(diǎn)，但還需更多研究證實(shí)。