賀麗娜，胡楊志，周 軒，胡志立

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科 湖南郴州 423000

胃癌是一種常見(jiàn)的起源于胃黏膜上皮的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素、多階段的發(fā)展過(guò)程，涉及一系列癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等的表達(dá)[1]。PROX1是一個(gè)能夠調(diào)控細(xì)胞分化發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在人類(lèi)肝臟、神經(jīng)元等的發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要[2]。目前的研究[3-5]顯示，PROX1在肺癌、腎癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而在原發(fā)性肝癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明其在不同的腫瘤組織中可能發(fā)揮不同的作用。研究[6]顯示，PROX1可以正調(diào)控腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。有研究[7]報(bào)道，PROX1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，并且其表達(dá)水平的高低與胃癌的病理分期、轉(zhuǎn)移等具有相關(guān)性。本研究觀察了沉默PROX1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，為靶向基因治療胃癌提供新途徑。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑胃癌AGS細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、兔抗PROX1抗體購(gòu)自南京安研生物科技有限公司；兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體、兔抗波形蛋白(Vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)LifeSpan Biosciences公司；PROX1、β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PROX1 siRNA和陰性對(duì)照慢病毒GV118購(gòu)自廣州輝駿生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將AGS細(xì)胞按照每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，孵育培養(yǎng)1 d后，將細(xì)胞分成空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組3組，每組3孔，在陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞中分別添加PROX1 siRNA慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒，空白對(duì)照組中不添加慢病毒，病毒感染MOI=20，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)3 d。置于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，感染效率高于85%可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PROX1mRNA表達(dá)3組細(xì)胞分別用Trizol裂解試劑提取RNA，取5 μL RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，步驟同反轉(zhuǎn)錄試劑盒。PCR引物：內(nèi)參β-actin正義鏈5’-ATAGCACAGCCTGGAT AGCAACGTAC-3’，反義鏈5’-CACCTTCATACAAT GAGCTGCGTGTG-3’，產(chǎn)物大小203 bp；PROX1正義鏈5’-CAGCGGTCTCTCTAGTACAGG-3’，反義鏈5’-AGCGATCCATATCAAACTGGC-3’， 產(chǎn)物大小108 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算PROX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PROX1蛋白表達(dá)把3組細(xì)胞培養(yǎng)液吸盡，添加細(xì)胞裂解液，將培養(yǎng)板置于冰上，充分裂解30 min，以移液槍吹打細(xì)胞并吸取裂解液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)， 4 ℃、12 000×g離心5 min。吸取離心后的上清溶液，保存在-20 ℃。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。把蛋白同上樣緩沖液混勻后煮沸5 min。每個(gè)泳道上樣量為40 μg，首先以60 V電壓在濃縮膠中電泳，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠的下部邊緣方可終止電泳。電轉(zhuǎn)膜條件：60 V轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜溫度4 ℃。免疫反應(yīng)：50 g/L脫脂奶粉液封閉1 h，置于TBST中洗滌3次，與1∶600稀釋的一抗室溫孵育2 h，置于TBST中洗滌3次，再與1∶2 000稀釋的二抗室溫結(jié)合2 h，置于TBST中洗滌3次。ECL化學(xué)發(fā)光法測(cè)定PROX1和內(nèi)參β-actin條帶的光密度值，PROX1蛋白相對(duì)表達(dá)量=PROX1光密度值/β-actin光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況以3 000個(gè)細(xì)胞/孔將3組細(xì)胞接種到96孔板中，放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4天將培養(yǎng)板取出，添加20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。用移液槍吸除培養(yǎng)液，繼續(xù)添加150 μL的DMSO，置于室溫下混合10 min，測(cè)定每孔在570 nm的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：3組細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為8×104個(gè)/mL，在Transwell小室的上室中添加200 μL的細(xì)胞懸液，在下室中添加500 μL含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠在37 ℃濕化Transwell小室30 min，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)步驟同1.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。陰性對(duì)照組、干擾組PROX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；3組間PROX1、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量及A值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組細(xì)胞中PROX1表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。干擾組AGS細(xì)胞中PROX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

1:空白對(duì)照組;2:陰性對(duì)照組;3:干擾組

表1 3組細(xì)胞中PROX1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.23組細(xì)胞增殖能力的比較結(jié)果見(jiàn)表2。MTT結(jié)果顯示，干擾組AGS細(xì)胞在第1、2、3、4天的A值均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

表2 3組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)A值的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.33組細(xì)胞侵襲和遷移能力的比較結(jié)果見(jiàn)表3。干擾組AGS細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

表3 3組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.43組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表4。與其他2組比較，干擾組AGS細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高。

1:空白對(duì)照組;2:陰性對(duì)照組;3:干擾組

組別nMMP-2MMP-9E-cadherinVimentin空白對(duì)照組30.66±0.060.50±0.060.08±0.020.29±0.03陰性對(duì)照組30.64±0.070.47±0.080.07±0.040.30±0.05干擾組30.25±0.03?0.29±0.06?0.27±0.03?0.12±0.02?F51.1608.53739.41424.237P<0.0010.018<0.0010.001

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

PROX1基因定位于人1q32.2-1q32.3染色體上，編碼大小為83 000的蛋白質(zhì)。PROX1在發(fā)育和成熟大鼠的腦中表達(dá)，能夠促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶腦區(qū)新顆粒細(xì)胞的發(fā)育，從而發(fā)揮促進(jìn)記憶形成的作用，也是調(diào)控淋巴管生成的基礎(chǔ)因子[8-9]。PROX1在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，有的觀點(diǎn)認(rèn)為PROX1是一種腫瘤抑制因子，而另外一些研究結(jié)果則顯示PROX1是一種腫瘤促進(jìn)因子[3,6,10-11]。有研究[7,12]表明，PROX1在胃癌和癌旁組織中均有表達(dá)，且PROX1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，PROX1可能在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用。本研究結(jié)果表明，沉默PROX1表達(dá)后的胃癌AGS細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均降低，提示PROX1在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用。

癌癥患者死亡與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分散進(jìn)入胞外基質(zhì)，此時(shí)腫瘤細(xì)胞可以分泌蛋白酶將胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致基底膜的完整結(jié)構(gòu)受到破壞，腫瘤細(xì)胞通過(guò)這種方式穿透血管基底膜進(jìn)入血管組織，形成轉(zhuǎn)移[13-14]。MMPs在腫瘤侵襲和遷移的一系列復(fù)雜過(guò)程中具有重要作用，MMP-2和MMP-9是明膠酶，是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的MMPs[15]。PROX1具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用，并且其表達(dá)水平的高低與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果表明，沉默PROX1表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，提示沉默PROX1表達(dá)可以通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞合成MMPs降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

機(jī)體內(nèi)EMT有兩種作用，既有生理作用，又可以表現(xiàn)為病理作用，病理性的EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移、組織纖維化等有關(guān)[17-18]。EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞極性喪失并獲得間質(zhì)特性，EMT能夠誘導(dǎo)良性腫瘤發(fā)展為惡性轉(zhuǎn)移性腫瘤。EMT相關(guān)蛋白E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在腫瘤組織中表達(dá)減少，Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。研究[19-21]顯示，肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等各種類(lèi)型的腫瘤轉(zhuǎn)移中均存在EMT，EMT也是腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。在腎癌組織中的研究[6]表明，PROX1具有正調(diào)控Vimentin表達(dá)、負(fù)調(diào)控E-cadherin表達(dá)的作用。本研究結(jié)果表明，沉默PROX1表達(dá)后胃癌細(xì)胞中的Vimentin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高，提示沉默PROX1可以明顯抑制胃癌細(xì)胞EMT水平。

綜上所述，PROX1可能在胃癌發(fā)生中發(fā)揮促進(jìn)作用，沉默其表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT水平，減少細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶。