陳南耀，余 丹，陳曉東

1)?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 海口 571199 2)?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 ?？?570208 3)?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)外科 ?？?570208

腦栓塞、休克、顱腦損傷等誘導的腦缺血再灌注損傷是引起腦組織功能障礙的重要原因，其中氧化應激是缺血再灌注神經(jīng)損傷發(fā)生的重要機制[1]。Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)在人類幾乎所有的組織和器官中均有表達，是一個與炎癥、細胞生長等有關的調(diào)控因子[2]。TLR4與神經(jīng)損傷發(fā)生有關，其在缺氧復氧損傷的腦神經(jīng)組織中高表達，表達水平與神經(jīng)損傷程度呈正比[3-4]。H2O2可誘導多種細胞發(fā)生氧化應激反應[5-6]。本實驗以負載TLR4 shRNA的慢病毒感染大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞，觀察H2O2干預后細胞中TLR4的表達，以及細胞增殖、凋亡能力和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-myc表達的變化，探討TLR4在PC12細胞氧化損傷中的作用，以期為明確神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料PC12細胞由中科院細胞庫提供；TLR4抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞合成；TLR4 shRNA慢病毒及對照空病毒均由湖南豐暉生物科技有限公司構建；β-catenin抗體、c-myc抗體購自美國Abcam公司。

1.2實驗分組將PC12細胞接種到6孔板(種植密度3×104個/孔)，在顯微鏡下觀察細胞融合為40%時，分別添加TLR4 shRNA慢病毒及空病毒液，感染復數(shù)設置為10。感染12 h后，棄掉培養(yǎng)上清液，添加細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后，于熒光顯微鏡下觀察，證實干擾效率超過90%。取感染 TLR4 shRNA慢病毒及空病毒的PC12細胞，用200 μmol/L的H2O2(以細胞培養(yǎng)液配制)培養(yǎng)6 h，記為shRNA+H2O2組和空病毒+H2O2組。不感染慢病毒的PC12細胞分別用0和200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)6 h，分別記為空白對照組和H2O2組。

1.34組細胞中TLR4mRNA的檢測分別收集4組細胞，用PBS洗滌后，Trizol法提取總RNA，按照37 ℃15 min、85 ℃5 s、4 ℃10 min進行反轉錄，以合成的cDNA為模板進行熒光定量PCR。引物序列為：TLR4上游5’-GGTGGAAGTTGAAGGAAT-3’，下游5’-AGATGATACCAGCACGAC-3’；GAPDH上游5’-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3’，下游5’-GT GACCAGGCGCCCAATAC-3’。反應條件：95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。以GAPDH為參照，采用2-ΔΔCt法計算TLR4 mRNA表達水平。實驗重復3次。

1.44組細胞中TLR4蛋白的檢測分別收集4組細胞，用PBS洗滌后，加RIPA裂解液于冰上孵育20 min，轉移到4 ℃離心機中，12 000×g離心10 min。用移液槍吸取上清，BCA法定量蛋白樣品。常規(guī)方法配制SDS-PAGE凝膠。蛋白上樣量40 μg，上樣前用等體積緩沖液混合煮沸5 min。積層膠電泳電壓為90 V，分離膠電泳電壓為120 V，轉膜電壓90 V。蛋白轉移到PVDF膜后，以BSA封閉非特異性位點。一抗按照1∶600稀釋，二抗按照1∶4 000稀釋。分別在封閉、一抗孵育和二抗孵育后以TBST洗膜3次。ECL發(fā)光，以Chemi Doc XRS成像。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.5MTT法測定細胞存活率將PC12細胞按照3×104個/mL密度種植到96孔板，每孔100 μL，按照1.2分組處理后，每孔分別添加MTT溶液20 μL孵育4 h，棄上清，加DMSO溶解結晶，于酶標儀上測定490 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A/空白對照組A×100%。實驗重復3次。

1.6Annexin V-FITC和PI雙染法測定細胞凋亡分別收集4組細胞，以PBS配制成106個/mL的細胞懸液。吸取1 mL細胞懸液，離心，加200 μL結合緩沖液，加入各5 μL的PI和Annexin V-FITC染液混合孵育15 min，再添加300 μL緩沖液混勻，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7Western blot法測定細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平分別收集4組細胞，用Western blot法測定細胞中β-catenin、c-myc表達水平。β-catenin、c-myc抗體分別以封閉液按照1∶500稀釋，其余步驟同1.4。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0分析實驗數(shù)據(jù)，4組細胞中TLR4 mRNA和蛋白表達水平、細胞存活率和凋亡率、細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.14組細胞中TLR4mRNA和蛋白表達水平的比較見圖1和表1。H2O2組細胞中TLR4表達水平較空白對照組升高，shRNA+H2O2組細胞中TLR4的表達較H2O2組降低。

1、2、3、4：分別為空白對照組、H2O2組、空病毒+H2O2組、shRNA+H2O2組

圖1 4組細胞中TLR4蛋白的表達

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

2.24組細胞存活率和凋亡率的比較見表2。H2O2組細胞存活率降低，細胞凋亡率增加。shRNA+H2O2組細胞凋亡率較H2O2組降低，存活率升高。

2.34組細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平的比較見圖2和表3。H2O2組細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平較空白對照組降低。shRNA+H2O2組細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平較H2O2組升高。

表2 4組細胞存活率和凋亡率的比較 %

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

1、2、3、4：分別為空白對照組、H2O2組、空病毒+H2O2組、shRNA+H2O2組

圖2 4組細胞中β-catenin、c-myc蛋白的表達

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

3 討論

腦血管疾病的發(fā)生與缺血再灌注損傷有關[7-9],氧化應激是腦組織缺血再灌注損傷的主要機制之一。氧化應激可以誘導神經(jīng)細胞凋亡，抑制神經(jīng)細胞生長，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[10-11]。本研究結果顯示，H2O2處理后PC12細胞生長能力降低，凋亡細胞增多。

TLR4是Toll樣受體蛋白家族成員，能夠識別革蘭陰性菌細胞壁的有效成分，其在氧化應激誘導的心肌損傷、腎小管上皮細胞損傷等多種細胞損傷中具有重要的調(diào)控作用[12-13]。目前的研究[14]顯示，TLR4參與機體免疫反應和腦缺血損傷發(fā)生，腦缺血損傷可以誘導炎癥反應，進而引起氧化應激，導致細胞組織結構破壞。研究[15]顯示，黃芪甲苷在減輕缺氧復氧PC12細胞損傷的同時可以下調(diào)TLR4的表達，TLR4可能參與缺氧復氧PC12細胞凋亡過程。本實驗結果顯示，H2O2處理后PC12細胞中TLR4蛋白和mRNA表達水平均升高，敲減TLR4后H2O2誘導的PC12細胞凋亡率降低，細胞存活率增加，提示TLR4可能在PC12細胞氧化應激損傷中發(fā)揮促進作用。

TLR4具有調(diào)控細胞生長和凋亡的作用，并且對于不同細胞調(diào)控作用不同。有研究[16-19]表明，TLR4可以抑制神經(jīng)細胞Wnt信號通路的激活；可以負調(diào)控破骨細胞Wnt信號通路，提高細胞增殖活性；可以激活乳腺癌、骨髓間充質干細胞中Wnt信號通路，促進細胞增殖。也有研究[20]表明，抑制Wnt信號通路可以加重百草枯誘導的PC12細胞凋亡。本實驗結果表明，H2O2處理后的PC12細胞中Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白β-catenin及下游靶基因c-myc表達下調(diào)，敲減TLR4可以提高H2O2誘導的PC12細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平，說明敲減TLR4能夠促進PC12細胞中的Wnt/β-catenin信號通路的激活，這可能是其抗PC12細胞損傷的作用機制。

總而言之，TLR4在神經(jīng)細胞氧化損傷中可能發(fā)揮促進作用，作用機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的激活水平有關。