方興根，盛 斌

1)皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科 安徽蕪湖 241001 2)皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 安徽蕪湖 241001

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高侵襲性、易復發(fā)、病死率高等特點，目前尚無有效的治療方法[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼的單鏈小分子RNA，可通過特異性結(jié)合于靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)，引起靶基因mRNA降解或翻譯受阻，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達[2]。研究[3]顯示，miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-577是miRNA大家族成員之一，有研究[4-5]表明，miR-577與乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤細胞生長密切相關(guān)。有研究[6]顯示，長鏈非編碼RNA ZEB1-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-577促進腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移。Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中的經(jīng)典信號途徑，其激活可促進多種腫瘤細胞生長，Wnt2b是Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵分子，有研究[7]表明，miR-577可通過調(diào)節(jié)Wnt2b抑制非小細胞肺癌增殖和上皮細胞間充質(zhì)化。miR-577是否可通過調(diào)節(jié)Wnt2b影響腦膠質(zhì)瘤細胞生長還未明確。因此，本研究將過表達miR-577載體轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細胞，并驗證miR-577與Wnt2b的靶向關(guān)系，旨在探討miR-577是否可靶向調(diào)節(jié)Wnt2b從而影響U251細胞活力和凋亡。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器人腦膠質(zhì)瘤U251細胞購自美國ATCC公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Trizol試劑、脂質(zhì)體2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1質(zhì)粒購自湖南豐暉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2細胞培養(yǎng)U251細胞用含體積分數(shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在體積分數(shù)5%、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、消化傳代。取對數(shù)生長期U251細胞，以2×105個/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細胞達80%融合。將U251細胞分為miR-對照組(轉(zhuǎn)染miR-577陰性對照)、miR-577組(轉(zhuǎn)染miR-577模擬物)、抑制對照組(轉(zhuǎn)染miR-577抑制物對照)、miR-577抑制組(轉(zhuǎn)染miR-577抑制物)以觀察上調(diào)及下調(diào)miR-577表達后Wnt2b表達的變化；將U251細胞分為miR-對照組、miR-577組、miR-577+Wnt2b組(轉(zhuǎn)染miR-577模擬物與pcDNA-Wnt2b)以驗證miR-577是否通過調(diào)控Wnt2b表達進而調(diào)控細胞增殖及凋亡；各組細胞均轉(zhuǎn)染6 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3qRT-PCR檢測miR-577表達Trizol法提取轉(zhuǎn)染48 h的細胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應體系及條件，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-577 上游引物5’-TGCGGTAGATAAAATATTGG-3’, 下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;內(nèi)參U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’, 下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，共35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-577相對表達量。實驗重復3次。

1.4CCK-8法檢測細胞活力取對數(shù)生長期的U251細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育24 h，按1.2分組處理U251細胞，于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育4 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值，以A值表示細胞增殖能力，每組設(shè)置5個復孔，實驗重復3次。

1.5細胞凋亡率的檢測收集轉(zhuǎn)染后48 h的U251細胞，制備成單細胞懸液，離心，棄掉上清，PBS重懸細胞，取(1～5)×105個細胞，在細胞懸液中分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后避光室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.6miR-577靶基因預測及驗證通過靶基因軟件miRDB、miRNA.org和TargetScan 7.1分析，發(fā)現(xiàn)Wnt2b 3’UTR與miR-577種子區(qū)存在結(jié)合位點。構(gòu)建野生型(WT)及突變型(MUT)Wnt2b 3’UTR區(qū)熒光表達質(zhì)粒pGL3-Wnt2b，并與miR-577模擬物或抑制物共轉(zhuǎn)染U251細胞，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明測定各組細胞的熒光強度。實驗重復3次。

1.7Wnt2b蛋白表達的檢測將適量RIPA裂解液加入轉(zhuǎn)染后的細胞中，在冰上裂解反應30 min，離心，收集上清。BCA法測定蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃變性5 min。在每孔加入40 μg變性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)蛋白于PVDF膜及50 g/L脫脂奶粉液封閉膜，加鼠抗人Wnt2b抗體(美國Santa Cruz公司，1∶500稀釋)及內(nèi)參鼠抗人GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司，1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加HRP標記的羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)，37 ℃搖床振蕩封閉1 h，洗膜，ECL顯色。Quantity One軟件進行灰度值分析。以Wnt2b與GAPDH條帶灰度值比值作為Wnt2b蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。不同組間U251A值、凋亡率、Wnt2b蛋白相對表達量及3’UTR熒光素酶活性的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1U251細胞的轉(zhuǎn)染效果以miR-對照組為1，miR-577組miR-577表達水平(6.183±0.597)升高。

2.2miR-577靶基因預測及Wnt2b蛋白表達測定結(jié)果miR-577組與miR-對照組比較，3’UTR WT熒光素酶活性及Wnt2b蛋白表達水平降低；miR-577抑制組與抑制對照組比較，3’UTR WT熒光素酶活性及Wnt2b蛋白表達水平升高。見圖1、圖2、表1。

圖1 miR-577與Wnt2b 3’UTR的結(jié)合位點(紅色部分)

1：miR-對照組；2：miR-577組；3：抑制對照組；4：miR-577抑制組

圖2 4組U251細胞Wnt2b蛋白的表達

*：與miR-對照組和抑制對照組比較，P<0.05

2.3上調(diào)Wnt2b對miR-577過表達的U251細胞活力和凋亡的影響結(jié)果見表2?？芍?，miR-577組與miR-對照組比較，細胞活力降低，凋亡率升高；miR-577+Wnt2b組與miR-577組比較，細胞活力升高，凋亡率降低。

表2 3組U251細胞活力和凋亡率比較(n=3)

*：與miR-對照組比較，P<0.05；#：與miR-577組比較，P<0.05

3 討論

與多數(shù)人類腫瘤類似，腦膠質(zhì)瘤也是由多程序、多基因發(fā)展演變而來，各種致癌因素可激活一種或多種癌基因，或抑制抑癌基因，從而引起細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移異常[8]。研究[9]表明，miRNA在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，多個miRNA的異常表達可影響腦膠質(zhì)瘤細胞生長。miR-577可影響腫瘤細胞生長，如過表達miR-577能夠顯著抑制SGC-7901細胞侵襲能力[10]；miR-577可通過靶向β-catenin抑制肝癌細胞生長[11]。以上研究提示miR-577在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用，但目前miR-577在膠質(zhì)瘤中的研究較少。因此，本研究將過表達miR-577的載體轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細胞，通過CCK-8及流式細胞術(shù)分別檢測細胞活力和凋亡率，發(fā)現(xiàn)過表達miR-577可明顯抑制U251細胞活力和誘導細胞凋亡，提示miR-577可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞生長。

Wnt/β-catenin信號通路是一種在進化中高度保守的信號途徑，參與細胞生長、增殖、凋亡、能量代謝等多種生物學過程的調(diào)控，其異常激活與多種腫瘤細胞生長密切相關(guān)[12-13]。有研究[14-15]顯示，Wnt/β-catenin信號通路異常激活可影響腦膠質(zhì)瘤細胞生長。Wnt2b是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵分子，在多種腫瘤中呈現(xiàn)陽性表達，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[16]。有研究[17]顯示，miR-185-3p可通過靶向Wnt2b調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞侵襲和遷移能力；上調(diào)lnc-SNHG1可通過抑制miR-577和激活Wnt/β-catenin信號促進骨肉瘤進展[18]。本研究通過雙熒光報告基因檢測系統(tǒng)證實Wnt2b是miR-577的靶基因。將過表達miR-577和Wnt2b載體同時轉(zhuǎn)染U251細胞，發(fā)現(xiàn)過表達Wnt2b可減弱miR-577對細胞活力的抑制和促凋亡作用，提示miR-577可通過下調(diào)Wnt2b抑制腦膠質(zhì)瘤細胞生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-577可抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞活力，誘導細胞凋亡，其機制是靶向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵分子Wnt2b，提示miR-577可能是腦膠質(zhì)瘤治療中的一個有效分子靶點。但目前關(guān)于miR-577在腦膠質(zhì)瘤細胞中的作用及機制研究相對較少，因此還需做進一步的深入研究。