周曉毓 趙建偉 馬貴敏 賈紅霞

摘?要?檢測(cè)端粒酶活性對(duì)腫瘤、癌癥的早期診斷，以及開(kāi)發(fā)以端粒酶為靶標(biāo)分子的抗腫瘤、抗癌藥物具有重要意義。本研究基于陽(yáng)離子共軛聚合物Poly[（9，9-bis（6'-N，N，N-trimethylammonium）hexyl）fluorenylene phenylene （PFP）與熒光染料SYBR Green I （SG）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，建立了一種簡(jiǎn)單快速的端粒酶活性檢測(cè)方法。當(dāng)端粒酶存在時(shí)，引物探針被延伸，生成具有-（GGTTAG）n重復(fù)序列的DNA。然后通過(guò)鏈霉親合素與生物素的特異性作用將端粒酶延伸產(chǎn)物連接在磁性微球上。加入與端粒酶延伸產(chǎn)物匹配的探針-（CTAACC）2。端粒酶延伸產(chǎn)物形成雙鏈結(jié)構(gòu)之后加入SG，SG能夠特異性的嵌入到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中。最后，加入PFP。PFP是一種帶有正電荷的水溶性共軛陽(yáng)離子聚合物，可以通過(guò)靜電作用與雙鏈DNA發(fā)生吸附。PFP與嵌入在雙鏈結(jié)構(gòu)中的SG發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。根據(jù)FRET的效率可以實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶活性的定量檢測(cè)。本方法可以檢測(cè)到3.0×105個(gè)Hela細(xì)胞中提取的端粒酶活性。將本方法與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）反應(yīng)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，提高檢測(cè)的靈敏度，可以檢測(cè)到6.0×104個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性，靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。本方法簡(jiǎn)單、快速，無(wú)需標(biāo)記、擴(kuò)增過(guò)程，無(wú)酶參與，檢測(cè)成本低，靈敏度高。

關(guān)鍵詞?端粒酶; 活性; 陽(yáng)離子共軛聚合物; 熒光共振能量轉(zhuǎn)移; 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng); 無(wú)酶信號(hào)放大

1?引 言

在正常細(xì)胞中，端粒隨著細(xì)胞的有絲分裂而逐漸縮短，直至細(xì)胞凋亡[1，2]。端粒酶是一種具有反轉(zhuǎn)錄活性的核糖蛋白酶。它能夠以自身具有的RNA序列為模板，對(duì)端粒DNA進(jìn)行不斷復(fù)制，阻止其縮短，使細(xì)胞無(wú)限增殖，不再凋亡。端粒酶在正常細(xì)胞中（除永生細(xì)胞）活性很低，很難被檢測(cè)到; 它一般在腫瘤或癌細(xì)胞中被激活[3，4]。有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性表達(dá)高達(dá)85%，腫瘤或癌細(xì)胞的強(qiáng)大活性與端粒酶被激活密切相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)端粒酶活性可以實(shí)現(xiàn)腫瘤或癌癥的早期診斷。同時(shí)，建立靈敏的端粒酶檢測(cè)方法對(duì)開(kāi)發(fā)以端粒酶為靶標(biāo)分子的抗癌藥物具有重要意義[5，6]。

1994年，Kim等[7]提出了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增法（Telomerase repeat amplification protocal，TRAP）用于端粒酶活性的檢測(cè)。之后，各種基于TRAP的端粒酶活性檢測(cè)方法相繼被提出[8～11]。基于TRAP的端粒酶活性檢測(cè)方法，靈敏度較高，可以檢測(cè)到幾個(gè)癌細(xì)胞中的端粒酶活性（以癌細(xì)胞數(shù)量為活性單位）; 但是，PCR過(guò)程操作步驟復(fù)雜，需要多個(gè)變溫循環(huán)過(guò)程，耗時(shí)長(zhǎng); 擴(kuò)增過(guò)程有聚合酶的參與，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。而且，端粒酶抑制劑可能會(huì)抑制PCR反應(yīng)中聚合酶的活性，造成假信號(hào)的出現(xiàn)，不利于端粒酶抑制劑的篩選。

等溫?cái)U(kuò)增是近年出現(xiàn)的一類(lèi)恒定溫度下快速高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)。與PCR擴(kuò)增相比，等溫?cái)U(kuò)增無(wú)需不斷變換反應(yīng)溫度，耗時(shí)短，擴(kuò)增效率高，已被用于端粒酶活性的檢測(cè)。2010年，Ding等[12]建立了基于等溫循環(huán)鏈頂替擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)端粒酶活性的方法，可以檢測(cè)到40個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性。2012年，Tian等[13]建立的基于等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（IEXPAR）檢測(cè)端粒酶的方法可以檢測(cè)低至1個(gè)癌細(xì)胞中的端粒酶活性。2016年，Wang等[14]建立的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)端粒酶活性的方法，實(shí)現(xiàn)了無(wú)背景信號(hào)的擴(kuò)增，可以檢測(cè)到1個(gè)癌細(xì)胞中端粒酶的活性。這些基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)端粒酶活性的方法的靈敏度與TRAP法相當(dāng)。但是，這些擴(kuò)增技術(shù)都需要聚合酶的參與，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性信號(hào)，而且大多設(shè)計(jì)復(fù)雜，檢測(cè)成本較高。

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）是一種無(wú)需酶參與，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行交替雜交的信號(hào)放大技術(shù)。無(wú)酶參與能夠避免由聚合酶導(dǎo)致的假信號(hào)的出現(xiàn)，提高方法的檢測(cè)準(zhǔn)確性。2015年，Wang等[15]基于HCR建立了一種電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的方法。該方法可以檢測(cè)到2個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性。但該方法需要復(fù)雜的電極修飾過(guò)程，而且需要對(duì)金納米粒子進(jìn)行標(biāo)記，耗時(shí)長(zhǎng)，過(guò)程繁雜。2016年，Hong等[16]基于HCR，利用熒光成像進(jìn)行端粒酶活性分析。該方法可以檢測(cè)到1個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性，靈敏度高。該方法同樣需要對(duì)金納米粒子進(jìn)行標(biāo)記，而且需要結(jié)合金納米粒子與氧化石墨烯共同作用，設(shè)計(jì)復(fù)雜。張佳玉等[17]基于HCR和磁分離技術(shù)建立了一種非常簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè)端粒酶活性的方法。該方法將端粒酶延伸產(chǎn)物特異性的DNA探針作為HCR引發(fā)探針，利用熒光直接檢測(cè)信號(hào)放大結(jié)果，可以檢測(cè)到1×105個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性。該方法的主要缺點(diǎn)是靈敏度較低; 而且，DNA探針需要熒光標(biāo)記，增加了檢測(cè)成本。

共軛聚合物是一類(lèi)含有高度離域的π電子共軛結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。水溶性共軛聚合物具有獨(dú)特的光電特性和電解質(zhì)的靜電特性[18，19]。陽(yáng)離子共軛聚合物已被廣泛用于生物傳感器的開(kāi)發(fā)[20～23]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種獨(dú)特的熒光現(xiàn)象，已成為一種備受關(guān)注的新熒光檢測(cè)技術(shù)[24，25]。2017年，Chen等[26]建立的基于共軛聚合物與熒光素之間的FRET檢測(cè)端粒酶活性的方法可達(dá)到5個(gè)細(xì)胞/mL的檢出限，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，但同樣需要用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)成本較高。

Poly[（9，9-bis（6'-N，N，N-trimethylammonium） hexyl）fluorenylene phenylene （PFP）是一種能夠發(fā)射熒光的水溶性共軛陽(yáng)離子聚合物，由于其帶有正電荷，可與帶負(fù)電的生物大分子發(fā)生靜電吸附[27]。本研究利用陽(yáng)離子共軛聚合物-PFP與熒光染料-SG之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合HCR信號(hào)放大技術(shù)，建立了一種無(wú)需熒光標(biāo)記、無(wú)酶參與的端粒酶活性分析新方法。無(wú)酶參與可有效避免聚合酶導(dǎo)致的假信號(hào)出現(xiàn)，提高方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性; 結(jié)合HCR，有效提高了端粒酶活性檢測(cè)的靈敏度。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Fluorolog 3-211熒光光譜儀（法國(guó)Horiba Jobin-Yivon公司）; 2720 熱循環(huán)儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）; KYC 100C搖床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

3-[（3-膽胺丙基）-二甲基胺]丙烷磺酸（CHAPS）細(xì)胞裂解液（美國(guó)Millipore公司）。鏈霉親和素（Streptavidin）表面功能化的磁性微球（直徑 2.8 μm，10 mg/mL， 美國(guó)Dynal Biotech公司）。 20× SYBR Green I （SG） （DMSO溶劑，廈門(mén)致善生物技術(shù)公司）。PFP由中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所王樹(shù)課題組提供。實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。實(shí)驗(yàn)中所用DNA（聚丙烯酰胺電泳純化）購(gòu)于上海生物工程公司，序列見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)中所用緩沖溶液包括：1×PBS緩沖溶液（37 mmol/L NaCl， 10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4， 2.7 mmol/L KCl， pH 7.4）; 1×Tris-HCl緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl， 1.0 mmol/L EDTA， 2.0 mol/L NaCl， 0.05% Tween-20， pH 7.3）; 端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液（20 mmol/L Tris-HCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 70 mmol/L KCl， 1.0 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸 （EGTA）， 0.05% Tween-20， pH 8.3）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?端粒酶的提取?培養(yǎng)的Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)后用冷的1×PBS洗滌3次，在4℃以2000 r/min離心10 min。分離出的細(xì)胞加入冷的 1× CHAPS細(xì)胞裂解緩沖液，在冰上放置30 min，期間多次振蕩，以保證細(xì)胞充分裂解。然后在4℃以12000 r/min離心30 min。取出含有端粒酶的上層溶液，于80℃保存，備用。

2.2.2?端粒酶的延伸?取適量端粒酶提取液、10 μmol/L標(biāo)記生物素的端粒酶延伸引物（biotin-TS）、200 μmol/L dNTPs，在端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液中混合均勻，終體積為50 μL。置于熱循環(huán)儀中，37℃下進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)1 h; 90℃保持10 min，使端粒酶變性失活，終止反應(yīng)。

2.2.3?FRET反應(yīng)及熒光檢測(cè)?取5 μL磁球，用1×Tris-HCl緩沖溶液洗滌3次，用1×PBS緩沖溶液懸浮，加入50 μL端粒酶延伸產(chǎn)物和250 nmol/L DNA probe，在熱循環(huán)儀中70℃高溫變性10 min，45℃復(fù)性雜交20 min。取出后，不斷振蕩，降至室溫后進(jìn)行雜交。磁分離，棄去上清液。磁球懸浮在1×PBS緩沖溶液中，加入0.6×SG熒光染料和100 nmol/L PFP，總反應(yīng)體積100 μL。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，掃描范圍為400 ～650 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為4.5 nm。

2.2.4?基于HCR的FRET反應(yīng)及熒光檢測(cè)?取5 μL磁球，用1×Tris-HCl緩沖溶液洗滌3次。將磁球懸浮在1×PBS緩沖溶液中，加入適量端粒酶延伸產(chǎn)物和終濃度為250 nmol/L的DNA probe Ⅰ，總反應(yīng)體積100 μL。在熱循環(huán)儀中70℃高溫變性10 min，45℃復(fù)性雜交20 min，自然冷卻至室溫。磁分離，棄去上清液，分別加入500 nmol/L的DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ，懸浮在100 μL 1×PBS緩沖溶液中。在30℃以200 r/min孵育2 h，進(jìn)行HCR反應(yīng)。

將HCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行磁分離，棄去上清液，加入0.6×SG 熒光染料和125 nmol/L PFP，重新懸浮在100 μL 1×PBS中，檢測(cè)熒光信號(hào)。激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，掃描范圍為400～650 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為4.5 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?基于FRET檢測(cè)端粒酶活性的原理

基于陽(yáng)離子共軛聚合物PFP與SG之間的FRET檢測(cè)端粒酶活性的原理如圖1所示。生物素標(biāo)記的端粒酶引物（Biotin-TS）在端粒酶和dNTPs作用下發(fā)生延伸反應(yīng)，產(chǎn)生一條具有（GGTTAG）n重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物DNA。加入鏈霉親和素表面功能化的磁性微球（Steptavidin magnetic bead），通過(guò)Steptavidin-biotin的特異性結(jié)合，將端粒酶延伸產(chǎn)物連接到磁球上。而細(xì)胞提取物及延伸反應(yīng)中的其它反應(yīng)物通過(guò)磁分離去除。加入與端粒酶延伸產(chǎn)物重復(fù)序列匹配的DNA探針（DNA probe：（CTAACC）2）。DNA probe與端粒酶延伸產(chǎn)物結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。加入可與雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料SYBR Green I （SG），SG嵌入到雙鏈DNA的小螺旋結(jié)構(gòu)中，加入帶有大量正電荷的陽(yáng)離子共軛聚合物PFP，通過(guò)靜電作用與雙鏈DNA結(jié)合，形成PFP-dsDNA-SG三聚體結(jié)構(gòu)。PFP與SG之間的距離被拉近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。PFP的激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm。SG的激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為523 nm。通過(guò)檢測(cè)SG和PFP熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的比值（I523 nm/I425 nm）變化，從而檢測(cè)端粒酶活性。定義I523 nm/I425 nm為熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（FRET efficiency），端粒酶延伸產(chǎn)物越多，I523 nm/I425 nm越大，即PFP與SG之間FRET效率越高。

考察了本方法檢測(cè)端粒酶活性的可行性。首先考察合成的端粒酶延伸產(chǎn)物（biotin-STEP）的FRET反應(yīng)。空白溶液中不含合成的biotin-STEP，加入DNA probe不能形成雙鏈結(jié)構(gòu)，加入熒光染料SG無(wú)法發(fā)生PFP與SG之間的FRET。從圖2可見(jiàn)，空白溶液在425 nm處熒光峰（PFP熒光峰位置）強(qiáng)度很大，而523 nm處熒光峰（SG熒光峰位置）非常弱; 樣品在425 nm處熒光峰強(qiáng)度明顯降低，523 nm處熒光峰強(qiáng)度顯著增加。證明端粒酶延伸產(chǎn)物可以引起PFP與SG之間有效的FRET。