周洋洋 杜玉梅 卞曉軍 顏娟

摘?要?合成了核殼結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering， SERS）探針， 用于大型客體及曲面客體表面的潛指紋成像。以對硝基苯硫酚 （4-Nitrothiophenol， ?pNTP） 為拉曼小分子， 修飾在納米金表面， 然后在其表面覆蓋一層SiO2殼層， 制備Au@ pNTP@SiO2核殼納米結(jié)構(gòu)， 經(jīng)溶菌酶適配體功能化修飾制得SERS探針。對探針結(jié)構(gòu)進(jìn)行透射電鏡（TEM）、能量色散光譜（EDS）和SERS增強(qiáng)效應(yīng)的測試， 然后將探針與不同客體表面的老化潛指紋進(jìn)行孵育， 使SERS探針與指紋嵴線中的溶菌酶結(jié)合， 用透明膠帶轉(zhuǎn)移指紋， 采用共聚焦拉曼顯微鏡進(jìn)行SERS信號的檢測、成像。結(jié)果表明， 核殼SERS探針粒徑分布均一， 多集中于～60 nm， 具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和分散性; SERS增強(qiáng)效應(yīng)顯著， 其信號強(qiáng)度高、重現(xiàn)性好， 并且在723、855、1081、1343 和1572 cm1處具有顯著的特征峰。將SERS探針用于膠帶潛指紋成像時(shí)， 不僅可呈現(xiàn)指紋的一級結(jié)構(gòu)（圖案）， 而且指紋的二級結(jié)構(gòu)（細(xì)節(jié)）如嵴中斷、叉等結(jié)構(gòu)也清晰可見。本研究發(fā)展的適配體功能化的SERS探針結(jié)合膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋的指紋識別策略， 為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一種有效的潛指紋識別方法， 并在食品安全等公共安全檢測領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞?表面增強(qiáng)拉曼光譜探針; 核殼納米結(jié)構(gòu); 潛指紋; 拉曼成像

1?引 言

指紋因具有特異性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)， 在犯罪現(xiàn)場調(diào)查中發(fā)揮了重要作用[1，2]。犯罪現(xiàn)場的殘留指紋除了目視即可看見的明顯紋、手接觸柔軟物質(zhì)留下的成型紋外， 還有一些肉眼不可見的潛指紋。潛指紋是法醫(yī)最常接觸到的指紋， 手接觸身體分泌物（如汗液或油脂）再接觸物體表面留下的指紋即為潛指紋[3， 4]。選擇合適的方法增強(qiáng)潛指紋圖譜的成像效果， 對于實(shí)際的法醫(yī)鑒定具有重要意義。通常， 指紋的特征包括圖案、細(xì)節(jié)和精細(xì)結(jié)構(gòu)3個(gè)等級， 一級結(jié)構(gòu)即圖案包括常見的斗型指紋和簸箕型指紋， 二級結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)是指紋線的一些交叉、中斷等結(jié)構(gòu)， 除此之外， 指紋的嵴線上分布著很多汗孔， 為指紋的三級結(jié)構(gòu)。對于犯罪現(xiàn)場的一些殘缺無法得到完整圖案的指紋， 通過指紋細(xì)節(jié)確定身份至關(guān)重要; 其次， 隨著網(wǎng)絡(luò)化運(yùn)行的指紋系統(tǒng)的健全， 指紋識別在社會(huì)服務(wù)領(lǐng)域、經(jīng)濟(jì)活動(dòng)、社會(huì)管理， 甚至醫(yī)療診斷等方面也具有應(yīng)用價(jià)值[5]。社會(huì)服務(wù)方面， 公民選舉中， 運(yùn)用指紋鑒別手段， 可有效杜絕重復(fù)投票等現(xiàn)象; 金融方面， 可以使用銀行指紋密碼箱; 安全防范方面， 重要場所、保密機(jī)構(gòu)及住宅利用指紋識別可有效防止非法進(jìn)入。然而， 多數(shù)可視化方法對于指紋成像基底選擇性、通用性較差， 對于一些大型不可移動(dòng)客體表面或曲面的指紋成像具有較大的挑戰(zhàn)， 因此， 發(fā)展高分辨、普適化的指紋轉(zhuǎn)移成像技術(shù)， 以實(shí)現(xiàn)大型不可移動(dòng)客體表面及曲面潛指紋的細(xì)節(jié)和精細(xì)結(jié)構(gòu)的識別具有重要的現(xiàn)實(shí)需求和意義。

目前， 根據(jù)客體的不同， 潛指紋顯現(xiàn)方法可分為非滲透性、滲透性、半滲透性及多種客體表面的綜合顯現(xiàn)法[6]， 對于非滲透性客體表面的潛在指紋的顯現(xiàn)方法有光學(xué)顯現(xiàn)法、粉末顯現(xiàn)法、502膠顯現(xiàn)法。滲透性客體表面潛指紋顯現(xiàn)方法主要有茚三酮顯現(xiàn)法和物理顯影液顯現(xiàn)法， 但顯影液試劑具有易污染、價(jià)格昂貴、耗時(shí)久、工作液使用壽命短、對檢材破壞性較強(qiáng)等缺點(diǎn)。由于半滲透性客體上潛在手印的顯現(xiàn)較難處理， 通常使用幾種顯現(xiàn)技術(shù)的結(jié)合， 按照最佳的顯現(xiàn)程序進(jìn)行， 常見的熏顯法、多金屬沉積法作為適用于多種客體表面的綜合顯現(xiàn)法被廣泛使用。近年來， 隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展， 越來越多的新儀器被用于潛指紋的顯現(xiàn)[7，8]， 如熒光可視化[9～13]、場致發(fā)光法[14，15]、電化學(xué)發(fā)光法[16～19]和多金屬沉積法[20～23]等， 極大地提高了潛指紋顯現(xiàn)的靈敏度。另外， 質(zhì)譜法[24～27]在對潛指紋成像的同時(shí)， 可得到潛指紋中特定化合物的詳細(xì)化學(xué)信息， 但由于其局限于實(shí)驗(yàn)室使用， 且儀器復(fù)雜， 操作繁瑣， 不適合現(xiàn)場調(diào)查檢驗(yàn)。

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（Surface enhanced raman scattering， ?SERS）是一種振動(dòng)光譜技術(shù)， 由于其譜線寬度窄、靈敏度高、不受水分子干擾及對檢測體系的非破壞性特點(diǎn)， 被廣泛用于疾病診斷、分子檢測、食品安全檢測以及環(huán)境檢測等領(lǐng)域[28～32]?；赟ERS的潛指紋成像技術(shù)近年來備受關(guān)注[33～36]。然而， SERS技術(shù)存在信號不均一、重現(xiàn)性差等問題， 而核殼納米結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)為有效解決該問題提出了方案。目前， SERS技術(shù)對潛指紋可視化的報(bào)道多集中于對客體表面指紋的直接可視化分析， 對于大型不可移動(dòng)客體表面及曲面物體表面潛指紋的可視化具有較大的挑戰(zhàn)， 因此， 基于界面轉(zhuǎn)移的潛指紋成像方法開始受到關(guān)注[34，37，38]， 如Zhao等[34，35]使用聚多巴胺（PDA）膜包覆聚二甲基硅氧烷（PDMS）及等離子體銀納米顆粒（AgNPs@PDA@PDMS）， 覆蓋具有潛指紋的客體表面， 同時(shí)實(shí)現(xiàn)潛指紋轉(zhuǎn)移與成像。然而， PDMS的制作成本較高， 制作工藝也較為復(fù)雜， 不適于日常使用。

寡核苷酸適配體是通過體外選擇技術(shù)， 即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選出來的對靶標(biāo)具有特異性的單鏈寡核苷酸， 與抗原抗體相比， 適配體具有更高的生物穩(wěn)定性[39，40]。人體汗液中有四百余種多肽， 溶菌酶即為其一， 且在指紋嵴線中大量分布， 其適配體已被成功篩選出來[41，42]。本研究使用常見透明膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋， 并與SERS成像技術(shù)和適配體識別技術(shù)相結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)大型客體表面及曲面客體表面潛指紋的可視化。利用殼層隔離納米顆粒合成方法制備對硝基苯硫酚嵌入的金-二氧化硅-核殼納米結(jié)構(gòu)（Au@pNTP@SiO2）， 對硝基苯硫酚（4-Nitrothiophenol， ?pNTP）分子嵌于金核與二氧化硅殼層中間， 溶菌酶適配體作為核酸識別序列， 組裝在核殼結(jié)構(gòu)表面， 制得對溶菌酶有特異性識別作用的SERS探針。探針與指紋孵育， 并使用膠帶將指紋連帶修飾的SERS探針輕輕轉(zhuǎn)移至膠帶表面， 被轉(zhuǎn)移后的潛指紋可在共聚焦拉曼顯微鏡下， 以拉曼信號分子pNTP的特征峰（1350 cm1）進(jìn)行檢測成像。探針合成以及檢測示意圖見圖1。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JEM-2010透射電子顯微鏡（日本電子公司）; 恒溫磁力攪拌器 （上海司樂儀器有限公司）; UV-2540紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）; XploRA共聚焦拉曼顯微鏡（法國Horiba公司）

四氯金酸水合物（HAuCl4·H2O， 百靈威科技公司）; 檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）、乙腈和乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 對硝基苯硫酚（pNTP）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）和硅酸鈉溶液（美國Sigma-Aldrich 公司）。溶菌酶適配體序列5'-NH2-TTTTTTATCAGGGCTAAAGAGTG-CAGAGTTACTTAG-3'由生工生物工程有限公司合成。所有化學(xué)試劑均為分析純或更高， 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Au@pNTP@SiO2 SERS探針的制備?參照Frens方法[43]合成60 nm的納米金顆粒。首先， 取613 μL 1% 四水合氯金酸溶液加入到盛有50 mL水的圓底燒瓶中， 加熱回流至沸騰， 在劇烈攪拌的情況下加入0.5 mL新鮮配制的的檸檬酸三鈉溶液（1%）， 反應(yīng)至顏色變紅， 停止加熱， 冷卻至室溫。在納米金顆粒溶液中加入300 μL 對硝基苯硫酚乙醇溶液（1 mmol/L）， 攪拌反應(yīng)4 h。取600 μL APTMS溶液（1 mmol/L）加入到50 mL上述pNTP包裹的納米金顆粒溶液中， 室溫反應(yīng) 30 min， 加入4.8 mL 0.54%硅酸鈉溶液， 90℃油浴反應(yīng)30 min， 快速將圓底燒瓶于冰水浴中終止反應(yīng)。待冷卻至室溫后， 再加入300 μL 1mmol/L APTMS溶液攪拌反應(yīng)15 min， 備用。

2.2.2?溶菌酶適配體在Au@pNTP@SiO2表面的修飾?將制備的納米結(jié)構(gòu)（Au@pNTP@SiO2）用乙醇和乙腈分別離心清洗3～4次后， 加入乙腈復(fù)溶。加入3 mL 1 mmol/L 三聚氰酰氯乙腈溶液， 室溫反應(yīng)4 h。活化后的納米結(jié)構(gòu)用乙腈和乙醇離心清洗3次， 用2 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.4）復(fù)溶。將56 μL溶菌酶適配體（100 μmol/L）溶于300 μL硼酸鹽緩沖液中， 再加入上述活化后的納米結(jié)構(gòu)溶液中， 于室溫下輕微振蕩過夜。最后， 將反應(yīng)后的混合溶液離心清洗2～3次， 并用水復(fù)溶， 于4℃保存， 備用。

2.2.3?膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋的收集?志愿者首先用肥皂將手洗凈并干燥， 戴一次性PE手套至微微出汗， 摘下手套將指紋按壓在事先清洗干凈的玻片表面。待指紋老化16 h后， 取溶菌酶適配體修飾的SERS探針滴到玻片上指紋表面， 于室溫下孵育30 min， 然后用去離子水輕輕沖洗掉未識別的SERS探針。待孵育探針的指紋完全干燥后， 用透明膠帶輕輕覆蓋， 并按壓玻璃基底表面的指紋， 將孵育了探針的指紋完全轉(zhuǎn)移并粘附于膠帶上。

2.2.4?膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋的拉曼成像?膠帶上粘附的指紋應(yīng)用Horiba XploRA共聚焦拉曼光譜儀的拉曼成像系統(tǒng)進(jìn)行成像， 10×物鏡用于采集數(shù)據(jù)， 每個(gè)光譜數(shù)據(jù)收集時(shí)間為0.1 s。光譜記錄范圍為1200～1500 cm1， 并用1350 cm1處特征峰進(jìn)行拉曼成像， 數(shù)據(jù)點(diǎn)采集步長為20 μm。

3?結(jié)果與討論

3.1?Au@pNTP@SiO2 SERS探針的合成與表征

首先， 根據(jù)經(jīng)典的Frens方法[43]合成納米金顆粒， 然后通過金硫鍵相互作用連接對硝基苯硫酚與納米金顆粒， 使得納米金表面修飾上一層對硝基苯硫酚， 作為拉曼信號分子; 然后， 采用殼層隔離納米顆粒合成方法在其表面包覆一層超薄的SiO2層形成納米結(jié)構(gòu)。對所制備Au@pNTP@SiO2納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。如圖2A所示， 合成的金納米粒子的形貌較為均一， 分散性較好; 通過對透射電鏡圖片中的顆粒進(jìn)行尺寸的統(tǒng)計(jì)， 金納米顆粒的尺寸為（62.75±10）nm（圖2B）。 Au@pNTP@SiO2的透射電鏡圖如圖2C所示， 納米金核被一層亮的圓環(huán)均勻包裹， 說明納米金核表面成功包裹了一層均勻密閉的納米結(jié)構(gòu)， 厚度約為2 nm。EDS表征結(jié)果如圖2D所示， 在Au@pNTP@SiO2納米結(jié)構(gòu)中存在硅元素， 說明納米金核表面包覆了SiO2， 可有效避免外界環(huán)境的干擾， 確保了SERS信號的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性; 同時(shí)， SiO2殼層為溶菌酶適配體的修飾提供了充足的位點(diǎn)， 大大提高了指紋識別的效率。

通過在納米結(jié)構(gòu)表面修飾溶菌酶適配體以制備對指紋嵴線上分布的溶菌酶具有識別能力的SERS探針， 并對SERS探針的拉曼光譜特性進(jìn)行了考察， 結(jié)果如圖3A所示。修飾pNTP的納米金顆粒的SERS光譜（黑色線）、Au@pNTP@SiO2納米結(jié)構(gòu)的SERS光譜（紅色線）及修飾了適配體的SERS納米探針的SERS光譜（深藍(lán)色）均具有明顯的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明， 經(jīng)SiO2包覆以及溶菌酶適配體的組裝， 納米金表面的拉曼小分子的SERS信號并未受到影響， 說明包覆的SiO2層厚度（2 nm）適合; 過厚的SiO2會(huì)影響激光從殼層傳遞到金核的效率， 進(jìn)而影響SERS效應(yīng)。并且， 在圖3A中， pNTP在723、855、1081、1343和1572 cm1處具有明顯的特征峰， 與文獻(xiàn)[33，44]報(bào)道一致。這幾處特征峰分別對應(yīng)CS伸縮振動(dòng)、CH搖擺振動(dòng)、CS伸縮振動(dòng)、ONO伸縮振動(dòng)以及苯環(huán)的振動(dòng)模式。同時(shí)， 在100 s內(nèi)隨機(jī)選取了10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行了拉曼光譜的收集， 所得光譜如圖3B所示， 表明此核殼結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定且重現(xiàn)性良好的SERS信號， 并且增強(qiáng)效應(yīng)明顯。

3.2?膠帶轉(zhuǎn)移Au@pNTP@SiO2 SERS探針修飾潛指紋的SERS成像性能考察

進(jìn)一步對SERS探針與指紋中溶菌酶的識別能力進(jìn)行了驗(yàn)證。依照2.2.3節(jié)的方法， 在玻璃基底表面按壓指紋。由于犯罪現(xiàn)場的多數(shù)指紋為放置的老化指紋， 因此， 本研究將采集的新鮮指紋自然放置16 h進(jìn)行老化后， 與SERS探針孵育30 min， 去離子水輕輕沖洗掉多余的未鍵合SERS探針， 自然晾干， 于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。如圖4A所示， 未孵育探針時(shí)， 玻璃基底表面只有殘留在指紋線的灰塵， 無完整指紋紋路; 而孵育探針后（圖4B及圖5A）， 可見清晰指紋紋路， 并有大量顆粒狀物沉積于指紋的嵴線上（黑色箭頭）， 峪線上（白色箭頭）則無明顯的探針顆粒。溶菌酶在指紋的嵴線中大量分布， 孵育后， SERS探針與指紋嵴線上分布的溶菌酶結(jié)合， 大量沉積于指紋嵴線的表面， 而未特異性結(jié)合的峪線上的SERS探針則在沖洗的過程中被洗掉， 此結(jié)果說明， SERS探針具有良好的特異性和較高的識別效率。

用透明膠帶將鍵合了SERS探針的指紋輕輕揭下， 使鍵合了納米探針的指紋轉(zhuǎn)移于膠帶的表面， 于共聚焦拉曼顯微鏡下進(jìn)行拉曼檢測、成像。如圖5所示， 位于1350 cm1的pNTP的拉曼特征峰最為顯著， 因此， 選擇此處特征峰的信號值對潛指紋進(jìn)行檢測和成像分析。

比較了指紋的光學(xué)成像和拉曼成像的清晰度。如圖5A所示， 孵育探針后的指紋在光學(xué)成像下指紋圖案不清晰， 只能看出大致形狀; 圖5B為膠帶轉(zhuǎn)移后的玻璃表面的指紋SERS成像圖， 黑色的基底與紅顏色的拉曼信號鮮明對比， 可清晰地看到指紋的圖案， 并且指紋的二級結(jié)構(gòu)如嵴中斷、叉等也清晰可見。

此外， 結(jié)合法醫(yī)勘察現(xiàn)場時(shí)可能的情況， 對桌面、塑料制品這兩種客體表面按壓指紋， 并用膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋進(jìn)行SERS成像分析。圖5C為實(shí)驗(yàn)室桌面上按壓指紋孵育探針后轉(zhuǎn)移至膠帶表面后的拉曼成像， 可見清晰的指紋圖案， 指紋的嵴中斷、叉等二級結(jié)構(gòu)也清晰可見， 實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面未經(jīng)清潔洗凈以及未進(jìn)行任何前處理， 說明此成像技術(shù)在成像過程中不會(huì)受到灰塵等外來污染物的干擾; 而塑料包裝袋表面的指紋經(jīng)膠帶轉(zhuǎn)移成像（圖5D）中， 可見指紋一級結(jié)構(gòu)、部分二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)汗孔; 如圖5E中（ⅰ～ⅲ）所示， 圖 5D中指紋圖像的部分放大圖（黃色圓框所示位置）， 指紋的一級結(jié)構(gòu)， 即指紋線圖案; 叉、環(huán)點(diǎn)二級細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu); 指紋線上三級結(jié)構(gòu)即汗孔都清晰可見。由此可見， 無論玻璃、桌面、塑料制品表面， 本方法都可實(shí)現(xiàn)潛指紋的清晰成像， 具有很好的普適性。

SERS信號的均一性和重復(fù)性在高SERS效應(yīng)納米探針合成以及應(yīng)用于拉曼成像過程中至關(guān)重要。在指紋成像過程中隨機(jī)選擇16處不同位置采點(diǎn)進(jìn)行拉曼測試并作圖， 結(jié)果如圖5E所示， 不同位置的SERS信號強(qiáng)度差異性較小， 具有良好的均一性。圖5B中紅色指紋線的亮度也較為一致， 表明所制備的探針可顯示高效、均一的增強(qiáng)信號。同時(shí)， 圖中殘缺的指紋顯現(xiàn)是由于客體表面的指紋本就為殘缺指紋， 并非是該成像方法所致。當(dāng)用膠帶進(jìn)行指紋采集時(shí)需輕輕按壓， 將膠帶完全粘附于指紋表面再輕輕揭下， 大力刮擦則極可能破壞指紋的完整性。如圖5B右半部分所示（藍(lán)色框區(qū)域）， 由于大力刮擦導(dǎo)致膠帶上的指紋模糊成一片而無法進(jìn)行清晰成像。此時(shí)， 可將另一片膠帶覆蓋在指紋上， 并輕輕按壓， 通過兩片透明膠帶的相互黏附， 不僅能防止指紋不慎粘至其它基底而被破壞， 也便于采集至膠帶上指紋的長久保存。

4?結(jié) 論

針對法醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域中存在的大型不可移動(dòng)客體表面以及曲面客體表面的潛指紋識別問題， 發(fā)展了一種基于核殼SERS探針的膠帶轉(zhuǎn)移潛指紋的拉曼成像策略， 并成功實(shí)現(xiàn)了不同客體表面潛指紋的轉(zhuǎn)移及成像。通過溶菌酶適配體修飾的Au@pNTP@SiO2 核殼納米結(jié)構(gòu)與客體表面的指紋進(jìn)行孵育自然晾干后， 用膠帶轉(zhuǎn)移客體表面的SERS探針及指紋， 于共聚焦拉曼顯微鏡下進(jìn)行指紋的顯現(xiàn)。本方法不僅可顯現(xiàn)指紋的圖案， 還可識別至指紋的二級結(jié)構(gòu)。本方法還具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）Au@SiO2的核殼結(jié)構(gòu)有助于隔離外界環(huán)境對拉曼小分子的SERS效應(yīng)的干擾; （2）高特異性Aptamer的使用， 大大提高了探針對指紋嵴線中的溶菌酶識別效率; （3）透明膠帶價(jià)格低廉、易于獲得且操作簡便， 只需將制備的探針滴至客體指紋表面孵育30 min晾干， 用膠帶輕輕轉(zhuǎn)移后即可長久保留指紋并能隨時(shí)進(jìn)行指紋的成像; （4）實(shí)現(xiàn)了一些難以處理的大型客體及曲面客體表面的潛指紋識別。本研究發(fā)展的Au@pNTP@SiO2 SERS探針用于膠帶轉(zhuǎn)移客體表面指紋的成像策略為潛指紋識別提供了一種簡便、普適化、可識別至指紋二級結(jié)構(gòu)的有效方法， 實(shí)現(xiàn)了大型不易移動(dòng)的客體及曲面客體表面潛指紋的顯現(xiàn)， 對法醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域具有重要的意義， 同時(shí)， 通過修飾不同的適配體或抗體進(jìn)行功能化可實(shí)現(xiàn)指紋嵴線中不同代謝物的檢測， 對于非法吸毒、食品安全、公共衛(wèi)生安全等領(lǐng)域的檢測也具良好的應(yīng)用前景[45，46]。

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