賀衛(wèi)華+翟曉虎+宋幸輝

摘要：為了比較懷山藥與其他3種產(chǎn)地山藥的不同分子量段多糖含量以及各山藥多糖的活性，采取一步醇沉和分步醇沉法提取不同產(chǎn)地山藥的4種山藥多糖YPS總、YPS40、YPS60、YPS80；用MTT法測定各山藥多糖對PK-15細(xì)胞的安全濃度；然后分別從125 μg/mL倍比稀釋5個濃度，將4種山藥多糖以先加山藥多糖再加病毒的方式加至PK-15細(xì)胞培養(yǎng)體系中，用MTT法檢測PK-15細(xì)胞活性，實時熒光PCR法檢測PPV-SD1含量。結(jié)果表明：懷山藥多糖各分子量段的多糖含量均高于其他產(chǎn)地山藥，均以YPS80分子量段的多糖含量最高，且以懷山藥的YPS80的增強(qiáng)細(xì)胞活性和抗PPV-SD1感染效果最好?？梢姂焉剿幍乃幮ё饔脙?yōu)于其他產(chǎn)地山藥是有一定物質(zhì)基礎(chǔ)的。

關(guān)鍵詞：懷山藥；不同產(chǎn)地；分子量段；山藥多糖；活性

中圖分類號： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0312-03

山藥是藥食兼用植物，為薯蕷科植物薯蕷（Dioscores opposita Thunb.）的干燥塊莖，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的作用[1]，據(jù)《本草綱目》記載，山藥“益腎氣，健脾胃，止瀉痢，化痰涎，潤皮毛”。山藥種類繁多，種植廣泛，集中產(chǎn)于河南、陜西、山東等地，在諸多品種中以河南省焦作區(qū)域所產(chǎn)懷山藥最負(fù)盛名，其品種優(yōu)良，無論從藥用還是營養(yǎng)價值上均優(yōu)于其他產(chǎn)地的山藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中載有：“山藥以河南懷慶者良?！?/p>

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山藥具有多種生物活性，山藥多糖（yam polysaccharide，YPS）被認(rèn)為是山藥中主要的活性物質(zhì)之一[2]。山藥多糖能促進(jìn)小鼠、雞的免疫細(xì)胞增殖，提高特異性和非特異性免疫[3-4]。山藥多糖與豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）滅活疫苗同時使用，能顯著提高PRRSV抗體的產(chǎn)生[5]。山藥多糖體外對病毒感染細(xì)胞的作用，尚未見報道。多糖的分級沉淀是指使用不同濃度的甲醇或乙醇醇沉分離不同分子量段多糖的一種沉淀方法，為比較懷山藥與其他山藥中多糖含量與活性的不同，本研究對4種不同產(chǎn)地的山藥，采用一步醇沉和分步醇沉法分別提取到4種不同分子量段的山藥多糖，比較多糖得率，檢測各分子量段的多糖含量（純度），并以豬細(xì)小病毒（PPV）感染豬腎原傳代細(xì)胞PK-15為模型，體外試驗觀察山藥多糖抗PPV的活性，為懷山藥的藥效作用優(yōu)于其他山藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用河南省溫縣的懷山藥與產(chǎn)地為陜西省、山東省、廣東省的具有代表性的4個山藥樣品，均購自禹州市凱旋藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定均為薯蕷科植物薯蕷的干燥塊莖。

PPV-SD1毒株，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院惠贈。

豬腎原傳代細(xì)胞（porcine kidney 15，PK-15），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑

無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基，均購自美國Gibco公司；新生牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；苯酚、硫酸，購自洛陽市化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器

BG-50A電子稱，購自上海旭日衡器有限公司；GZX-9030 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子分析天平，購自島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；冷凍干燥機(jī)LABCONCO，購自上海醫(yī)械專機(jī)廠；722型可見分光光度計，購自上海分析儀器總廠。CO2培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；倒置顯微鏡，購自重慶光學(xué)儀器廠。

1.4 山藥多糖的制備

采用水提醇沉法制備山藥多糖：取不同產(chǎn)地山藥各 500 g，以藥水比例1 g ∶10 mL，浸泡30 min，煎煮1次，過濾；再以藥水比例1 g ∶8 mL煎煮，合并煎煮液，加熱濃縮至含生藥量 1 g/mL，一部分藥液用無水乙醇一步醇沉（乙醇終濃度為75%）過夜得YPS總，另一部分藥液使乙醇終濃度依次為40%、60%、80%，進(jìn)行分級醇沉得不同分子量段多糖，將各濃縮多糖膏置真空干燥器內(nèi)蒸干，得不同分子量段山藥多糖，即YPS總、YPS40、YPS60、YPS80，稱量各多糖質(zhì)量，計算多糖得率。并采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

多糖得率=多糖質(zhì)量/山藥質(zhì)量×100%。

1.5 山藥多糖對PK-15細(xì)胞安全濃度的測定

將不同產(chǎn)地總山藥多糖采用Sevag法[6]去蛋白，雙氧水去色素，柱層析后濃縮，將濃縮多糖膏置真空干燥器內(nèi)蒸干，得純化山藥總多糖，分別用細(xì)胞維持液從4 000 μg/mL開始2倍比稀釋10個濃度后，加到長成單層PK-15細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100 μL/孔，每個稀釋度重復(fù)6孔，另設(shè)PK-15細(xì)胞對照，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，MTT法[7]檢測安全濃度，以加山藥多糖孔D值不顯著低于PK-15細(xì)胞對照孔D值的最高濃度作為最大安全濃度。

1.6 山藥多糖抗PPV-SD1感染PK-15細(xì)胞能力的測定

參照Wang試驗結(jié)果[8]，將不同產(chǎn)地山藥的總山藥多糖分別從125 μg/mL倍比稀釋5個濃度。待PK-15細(xì)胞長成單層時，以先加山藥多糖后加PPV-SD1病毒的順序加到PK-15細(xì)胞中。每個濃度重復(fù)6次，同時設(shè)病毒對照組和細(xì)胞對照組。培養(yǎng)72 h后，待病毒對照出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時，MTT法測定PC-15細(xì)胞活性。采用實時熒光定量PCR方法檢測PPV-SD1含量[9]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析組間的差異性。

2 結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地不同分子量段山藥多糖的得率

由表1可知，河南省溫縣所產(chǎn)的懷山藥中山藥總多糖及各分子量段的多糖得率均高于其他3個產(chǎn)地，分級醇沉?xí)r，隨著乙醇濃度的提高，山藥多糖的得率有所增加，各產(chǎn)地山藥多糖得率由高到低的順序依次為河南省、山東省、陜西省、廣東省。

2.2 不同產(chǎn)地不同分子量段山藥多糖的含量

由表2可知，河南省溫縣所產(chǎn)的懷山藥中山藥總多糖及各分子量段的多糖含量均高于其他3個產(chǎn)地，分級醇沉?xí)r隨酒精濃度增高，所得多糖含量逐漸增大，且分級醇沉乙醇濃度達(dá)80%時，多糖含量高于總多糖的含量。各產(chǎn)地山藥多糖含量由高到低的順序依次為河南省、山東省、陜西省、廣東省。

2.3 不同產(chǎn)地山藥多糖對PK-15的安全濃度

如表3所示，各產(chǎn)地的山藥總多糖濃度為7.8～5 000 μg/mL 時，A570值不顯著小于細(xì)胞對照組，因此可將山藥多糖的最大安全濃度定為500 μg/mL；山藥總多糖濃度為 7.8～125 μg/mL 時，4種多糖的A570值都顯著大于細(xì)胞對照組（P<0.05），因此將后續(xù)試驗山藥多糖濃度均定為7.8～125 μg/mL。

2.4 山藥多糖抗PPV-SD1感染PK-15細(xì)胞的能力

如表4所示，山藥多糖濃度在7.8～125 μg/mL范圍內(nèi)，各山藥多糖處理組A570值顯著高于病毒對照組（P<0.05），且YPS80 在濃度為62.5、125 μg/mL時與細(xì)胞對照差異不顯著。

2.5 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)體系中PPV-SD1含量的變化

如表5所示，山藥多糖濃度在7.8～125 μg/mL范圍內(nèi)，山藥多糖處理組PK-15細(xì)胞培養(yǎng)體系中PPV-SD1含量均顯著低于病毒對照組（P<0.05）。

3 結(jié)論

山藥具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值及食用價值，含有多糖、淀粉、尿囊素等有效成分，具有降血糖、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等功效，山藥多糖以其獨(dú)特的功效成為近年來研究的重點。因此，開展山藥多糖的提取分離工藝研究，為開發(fā)山藥多糖的醫(yī)療保健功能提供理論依據(jù)，對山藥資源由粗加工向精制、深加工方向發(fā)展具有重要意義。

對于中藥多糖的提取，其基本的工藝都差不多，傳統(tǒng)的水浸提醇沉法是提取多糖的經(jīng)典方法，對山藥多糖的提取純化工藝研究也較多[10-12]，但對其分級醇沉的研究及對不同產(chǎn)地的山藥進(jìn)行多糖提取率及含量的研究也未見報道?；谝陨?點，本試驗采用一步醇沉及分步醇沉得不同分子量段的山藥多糖，比較不同產(chǎn)地山藥不同分子量段的多糖得率及多糖含量（純度）。結(jié)果顯示，無論是多糖得率還是各分子量段多糖純度，懷山藥均優(yōu)于其他產(chǎn)地山藥，這也可能是懷山藥藥用和營養(yǎng)價值均優(yōu)于其他產(chǎn)地山藥的原因之一，可見懷山藥的藥效作用優(yōu)于其他產(chǎn)地山藥是有一定物質(zhì)基礎(chǔ)的。

分級醇沉?xí)r，80%乙醇沉淀的分子段多糖含量高于總多糖及其他濃度醇級含量，這有可能顯示YPS80含有的多糖活性成分較高，對其不同分子量段多糖的活性比較研究，將會在后期試驗中進(jìn)一步研究。

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