文 進， 木葉沙爾·皮達義， 龔新記， 胡 昕， 郝艷艷， 閆 芳， 張立媛， 王 晶

(新疆醫(yī)科大學1第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學二科， 烏魯木齊 830028； 2第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心一病區(qū)， 烏魯木齊 830054)

近年來，全球支氣管哮喘(簡稱哮喘)的發(fā)病率和死亡率隨時間有逐漸上升的趨勢，給患者家庭和社會帶來明顯影響，已成為當今世界嚴重危害人類健康的疾病之一[1]。哮喘是一種多種細胞參與的慢性炎癥性疾病，而長期氣道炎癥的存在最終導致氣道重塑，由此可導致氣道不可逆性的阻塞和氣道高反應性。氣道重塑主要表現(xiàn)為上皮細胞化生、氣道壁的纖維化、平滑肌細胞增生和肥大、氣道壁血管的增生[2]。這些改變的嚴重程度與患者的病情呈正相關。解整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33)位于第20號染色體短臂13號位(20p13)，是近年來新發(fā)現(xiàn)的哮喘易感基因之一[3-4]，既往研究表明它存在于所有哮喘患者的支氣管平滑肌細胞和基底膜中，其表達水平高于正常對照組，且與哮喘的嚴重程度成正比。多項研究已經證實ADAM33與哮喘的氣道重塑相關[3, 5-6]。哮喘病因復雜，Thl/Th2細胞因子表達失衡是哮喘發(fā)病機制之一，而干擾素-γ(IFN-γ)是Th1細胞因子的代表，它通過調控Th1、Th2細胞因子活性變化進一步影響哮喘慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展。本研究探討IFN-γ對體外培養(yǎng)的人氣道壁血管平滑肌細胞ADAM33基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肺組織來源 2013年1月-2015年5月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科行手術治療的肺大泡患者的患肺切除的肺組織，該部分患者同時合并有支氣管哮喘。該研究已通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(批準號：20170214-50)，所有納入研究的患者都已簽署知情同意書。

1.1.2 儀器 去RNA酶，DNA酶槍頭，PCR試管，96孔PCR反應板，384孔PCR反應板，去離子水生成器，Nunc PCR cover，PCR反應擴增儀，7900HT q PCR系統(tǒng)，SW-CJ-1D潔凈工作臺，H6-1微型電泳槽，DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，YXJ-2離心機，凝膠成像系統(tǒng)，TU-1901紫外分光光度計，StepOne型熒光定量PCR儀，移液器。

1.1.3 試劑 IFN-γabcam抗體，DNase試劑盒，蛋白標記物，蛋白預染分子量標記物試劑盒，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，抗兔平滑肌a肌動蛋白單克隆抗體，小鼠β葡萄糖醛酸苷酶ELISA檢測試劑盒，標準胎牛血清，胰蛋白酶粉，RPMI-1640干粉培養(yǎng)基，D-Hanks粉，青霉素鈉、硫酸鏈霉素，核糖核酸酶抑制劑試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 分組 分成4個不同IFN-γ刺激濃度(0.1、1、10和100 ng/mL)的實驗組和1個空白對照組，5組中均加入相同體積的細胞培養(yǎng)液，同一環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，結束研究實驗。比較在不同IFN-γ刺激濃度下氣道壁血管平滑肌細胞ADAM33表達的變化。各實驗組及空白對照組均進行2次實驗。

另將支氣管血管平滑肌細胞和IFN-γ共培養(yǎng)，設置IFN-γ的刺激時間分別是0、6、12、24、48和72 h，同時設立沒有IFN-γ的空白對照組，每組中加入相同體積的細胞培養(yǎng)液，刺激結束后測定ADAM33基因表達。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 手術中切除的肺組織標本用D-Hanks液反復清洗，剝離組織中血管，把獲得的標本用組織剪成1 mm×1 mm的小塊，將小塊放入濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶液中，在37℃的溫度下保存15 min，使用離心機每分鐘980轉的速度離心10 min。將離心后的組織塊放入25 mL的培養(yǎng)瓶后在CO2恒溫箱中以37℃恒溫培養(yǎng)，同時加入濃度20%的胎牛血清，培養(yǎng)時間設定為3～4 h，每隔4～5 d換一次培養(yǎng)液，當沿著培養(yǎng)瓶周邊生長的細胞匯合到一起時，按1∶2進行傳代，每隔5～7 d傳代一次。使用顯微鏡觀察時發(fā)現(xiàn)，氣道壁血管平滑肌細胞有規(guī)律的平行排列在一起，呈“谷峰狀”。不斷擴增培養(yǎng)瓶內細胞，直至細胞數(shù)量增至2×106時，每個實驗組分別給予IFN-γ刺激。

1.2.3 RNA抽取 在刺激結束后加入1 mL Trizol試劑使細胞充分裂解，加入50 μL氯仿混勻15 s，放置5 min，以每分鐘13 000轉的速度 4℃恒溫下離心15 min；取上層液加入1∶1倍數(shù)的異丙醇和1 μL動物淀粉，震蕩均勻，靜置在-70℃的溫度下30 min，在4℃的溫度下以每分鐘13 000轉的速度離心15 min。棄上清液，使用75%的乙醇洗滌下層沉淀物，自然光下晾干，焦碳酸二乙酯溶解。

1.2.4 cDNA合成 在0.2 mL 體積PCR產物的試管中，按順序逐個加入以下試劑：5 μL RNA，1 μL Random Primer p(dN)，5 μL Rnase-free H2O?；靹蚝笠?0℃的溫度溫浴5 min，然后冰浴10 s后再次離心，并加入下列試劑：4.0 μL 5*Reaction Buffer，2.0 μL dNTP Mix，1.0 μL Rnase inhibitor，2.0 μL AMV Reverse Transcriptase，20.0 μL Total volume。最后將產物在37℃、42℃、70℃的溫度下分別溫浴5 min、60 min、10 min，溫浴結束后停止實驗，置-20℃環(huán)境中保存。

1.2.5 實時定量PCR分析 實驗開始前需要配制反應混懸液，所需試劑包括：cDNA模板2 μL，引物0.7 μL，MgCl20.3 μL，dNTP 0.75 μL，F(xiàn)CD 1 μL，SYBR Green I液2.5 μL，real time PCR buffer 5 μL，H2O 12.5 μL。將按照上述方法配制的樣品放置于95℃的恒溫下反應2 min，順次以95℃ 10 s、60℃ 40 s的順序重復40個循環(huán)。在熒光定量PCR儀中進行混合反應，并收集熒光信號。利用熒光定量分析儀采集實驗中定量PCR的結果，得出目的基因和參比基因的CT值。循環(huán)結束，繪制溶解曲線，如曲線無尖峰，則為陰性。

1.2.6 提取氣道壁血管平滑肌細胞蛋白 依據(jù)上述分組，將IFN-γ與氣道壁血管平滑肌細胞培養(yǎng)產物中加入2 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻后重復洗滌2～3遍，然后放置冰塊上；將10 μL PMSF與1 mL RIPA裂解液充分搖勻，取上述配制好的混合液400 μL緩慢加入到細胞瓶中，將細胞瓶放置于冰塊上30 min，待細胞粉碎裂解后，在4℃下離心12 min，轉速為每分鐘12 000轉；采用BCA蛋白定量的方法測定細胞瓶中的細胞總蛋白濃度，每個藥品終濃度均調整為2 μg/μL，以-80℃溫度下保存。

1.2.7 Western blot檢測ADAM33蛋白的表達水平 在每個樣品中提取等量的總蛋白，加入同體積loading buffer緩沖液，充分混合搖勻，在水浴鍋中煮沸5 min，在4℃的環(huán)境下放置，然后分別在60 V、120 V的電壓下電泳30和90 min。當溴酚蘭逐漸沉淀到底端的時候，停止電泳，開始轉模，轉模后采用免疫雜交的方法進行顯色分析，通過凝膠成像分析系統(tǒng)分析光密度。

2 結果

2.1 標準曲線和線性范圍依據(jù)不同的IFN-γ刺激濃度和刺激時間，繪制出環(huán)DNA模板濃度和基因CT值之間的關系曲線，曲線方程為Y=-3.356×log(X)+29.43，曲線斜率為-3.356，斜距為29.43，相關系數(shù)為0.986(圖1)。

2.2 RT-PCR產物分析ADAM33基因RT-PCR產物融解曲線在87℃時出現(xiàn)尖峰，且溶解溫度基本穩(wěn)定，具有高度的特異性(圖2)。利用PAGE電泳的方法獲得的蛋白產物性質比較穩(wěn)定，是目的條帶(圖3)。

圖1 cDNA模板濃度和基因CT值之間的關系曲線

圖2 ADAM33基因的融解曲線

圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳所得條帶(左圖為ADAM33蛋白電泳結果，右圖為ADAM33mRNA電泳結果)

2.3 給予不同濃度的IFN-γ刺激后ADAM33基因的表達情況實驗中，當給予較低濃度(0.1 ng/mL)IFN-γ刺激人氣道壁血管平滑肌細胞時，ADAM33 mRNA表達量較對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；之后ADAM33 mRNA的表達量隨著刺激濃度的增加有逐漸下降的趨勢。當IFN-γ濃度為1 ng/mL時，ADAM33 mRNA的表達量較對照組減少了(0.85±0.04)倍；當IFN-γ濃度為10 ng/mL時，ADAM33 mRNA的表達量減少了(0.74±0.02)倍；當IFN-γ濃度為100 ng/mL時，ADAM33 mRNA的表達量減少了(0.69±0.09)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。與對照組相比，不同濃度IFN-γ刺激下ADAM33蛋白表達量分別為(1.201±0.217)、(0.696±0.109)、(0.522±0.087)、(0.348±0.043)和(0.261±0.065)，呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ADAM33蛋白條帶灰度與對照組相比逐漸下降，差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖4 不同刺激濃度的IFN-γ對體外培養(yǎng)的人氣道壁血管平滑肌細胞ADAM33 mRNA表達的影響

圖5 不同刺激濃度IFN-γ對ADAM33蛋白表達的影響

2.4 給予IFN-γ刺激后不同時間的ADAM33基因的表達情況研究中使用一定濃度(100 ng/mL)IFN-γ刺激體外培養(yǎng)的人氣道壁血管平滑肌細胞時，ADAM33 mRNA的表達量隨著刺激時間的推移，先呈逐漸下降的趨勢后轉為逐漸上升的趨勢，各組的ADAM33 mRNA表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖6)。隨著不同刺激時間的變化，ADAM33蛋白表達量變化趨勢無明顯規(guī)律性，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。蛋白條帶前后灰度改變不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖7)。

圖6 IFN-γ刺激后不同時間點的體外培養(yǎng)的支氣管平滑肌細胞ADAM33 mRNA表達情況

圖7 恒定刺激濃度的IFN-γ刺激后不同時間ADAM33蛋白表達情況的變化

3 討論

ADAM33是目前世界上比較公認的哮喘易感基因之一。2002年由Van Eerdewegh等人[3]發(fā)現(xiàn)，并且他們對納入研究對象的460個高加索家族人群進行了全基因組掃描，檢測到位于人類染色體20p13的ADAM與哮喘密切相關，后又對該地區(qū)23個基因的135個基因多態(tài)性進行病例對照研究連鎖分析，最后確認ADAM33基因與哮喘相關。研究發(fā)現(xiàn)ADAM33可以在間充質細胞中選擇性表達，其活性改變可能會影響氣道內的平滑肌細胞和成纖維細胞的結果變化及功能異常，進而導致氣道重塑[6-8]。

IFN-γ是Th1細胞的一種細胞因子，介導細胞免疫，參與氣道內炎性細胞的調控，目前研究認為哮喘的發(fā)病機制與Thl型細胞因子(IFN-γ)反應減弱有關[9]。在哮喘的發(fā)病機制中，IFN-γ通過抑制Th2細胞的活性減輕患者氣道高反應性，從而減少嗜酸性粒細胞在氣道內的富集。Seyedrazavi等[10]在對比了哮喘患者與正常人的支氣管肺泡灌洗液后發(fā)現(xiàn)，哮喘患者肺泡灌洗液的IFN-γ的水平明顯低于正常人。故本研究選取具有代表性的IFN-γ，考慮研究個體細胞因子存在濃度及時間差異，故設計了濃度依賴性實驗及時間依賴性實驗。本研究結果顯示：IFN-γ刺激濃度和刺激時間的變化可以直接影響到ADAM33基因的表達，并且本研究中發(fā)現(xiàn)ADAM33基因的表達情況與IFN-γ的刺激濃度有一定的相關性，但是與IFN-γ的刺激時間的長短無關聯(lián)。Ito等[11]通過支氣管活檢標本進行研究發(fā)現(xiàn)ADAM33mRNA的表達量減少依賴時間及濃度，與本研究結果一致。此外，還有一些關于ADAM33與其他細胞因子的研究，諸如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-33等，上述研究均提示輔助細胞因子參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，且影響著ADAM33基因的表達[8,12-17]。

通過本研究證實IFN-γ可下調氣道壁血管平滑肌細胞ADAM33基因的表達，ADAM33參與了哮喘的血管重塑，那么IFN-γ通過什么通路或途徑影響ADAM33的表達，需要進一步的研究來證實。