齊婉婧，孫 奇，李 媛，張 雪，金美玉，何 巖，鄭志紅

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽(yáng) 110001)

雄性生殖細(xì)胞經(jīng)歷一系列特定基因程序性表達(dá)，使具有有絲分裂活性的原始生殖細(xì)胞發(fā)育為成熟精子的過(guò)程被稱為精子發(fā)生。精子發(fā)生起源于精原干細(xì)胞，經(jīng)歷精原細(xì)胞的有絲分裂期和精母細(xì)胞的減數(shù)分裂期[1]，在精子形成期圓形精子細(xì)胞經(jīng)歷復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重塑最終成為成熟精子[2]。精卵發(fā)生特異表達(dá)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1 (Spermatogenesis- and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1，Sohlh1)編碼357個(gè)氨基酸含有一個(gè)bHLH結(jié)構(gòu)域，SOHLH1可以形成異源二聚體或同型二聚體并與DNA上的E-box序列(CANNTG)結(jié)合[3]調(diào)控下游基因表達(dá)。SOHLH1在雄性生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，主要表達(dá)于A1-A4型精原細(xì)胞，在Int型及B型精原細(xì)胞中該蛋白逐漸消失[4]。SOHLH1是涉及精原細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，調(diào)控c-Kit表達(dá)[5]、與SOHLH2形成異源二聚體下調(diào)Stra8表達(dá)[6-8]并參與精子發(fā)生相關(guān)的重要信號(hào)通路[9]從而影響精原細(xì)胞發(fā)育和減數(shù)分裂。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Sohlh1基因敲除純合子雄性小鼠不育，精原細(xì)胞發(fā)育及分化異常導(dǎo)致進(jìn)入減數(shù)分裂的精母細(xì)胞減少，精母細(xì)胞大量凋亡，無(wú)成熟精子產(chǎn)生?；蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果顯示出生后7天野生型雄鼠與Sohlh1基因敲除雄鼠睪丸組織中Sox30、Rnf17等精子發(fā)生中關(guān)鍵基因均出現(xiàn)表達(dá)差異[10]，推測(cè)SOHLH1可能直接或間接調(diào)控Sox30基因轉(zhuǎn)錄。

Sox30是睪丸生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因Sox(Sry-related High Motility Group (HMG) box)家族H亞族唯一的成員，含有3個(gè)外顯子，編碼蛋白具有一個(gè)HMG box結(jié)構(gòu)域[11]，參與性腺發(fā)生、精子發(fā)生[12]并且與頂體形成相關(guān)[13]。Sox30基因敲除雄性小鼠無(wú)生育能力，精子發(fā)生阻滯于精子形成期，圓形精子細(xì)胞核表面沒有參與頂體形成的頂體顆粒[14]。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Sox30表達(dá)未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Sox30基因上游啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)存在SOHLH1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的E-box序列，本研究旨在探究精原細(xì)胞早期發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1參與精子發(fā)生后期相關(guān)基因Sox30的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步篩選Sox30基因啟動(dòng)子序列上SOHLH1特異性結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中共使用7周齡的SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠9只(三次重復(fù)實(shí)驗(yàn))，體重約22～24 g(誤差不大于10%)，來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SCXK(遼) 2018-0004]。取材在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(遼)2018-0008]，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)審查通過(guò)，審批編號(hào)：No. 2017018。

1.2 主要試劑與儀器

Tris平衡酚(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，北京)，PCR引物(Genescript，南京)，Q5? High-Fidelity DNA Polymerase(Cat.#M0491S，NEB，美國(guó))，Axygen mini-prepare 質(zhì)粒提取試劑盒(Cat.AP-MN-P-50)、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Cat.AP-GX-50)、AxyPrep PCR清潔試劑盒(Cat.AP-PCR-50)(Axygen，美國(guó))，pMD18-T Vector、E.coliDH5α感受態(tài)大腸桿菌、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ(寶生物公司，大連)，pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒(Promega，美國(guó))，T4DNA連接酶(NEB，美國(guó))，pcDNA3.0-Sohlh1真核表達(dá)質(zhì)粒(本課題組構(gòu)建)[15]，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(Invitrogen，美國(guó))，Dual-Luciferase? Report Assay Systerm試劑盒(Cat.# E1980，Promega，美國(guó))，EZ-ChIPTM-Chromatin Immunoprecipitation Kit試劑盒(Cat#17-371RF，Millipore，美國(guó))，SOHLH1抗體(3∶50，ab41520，Abcam，美國(guó))，PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))，Galaxy R二氧化碳培養(yǎng)箱(RS Biotech，德國(guó))，多功能酶標(biāo)儀(M200 PRO，Tecan，瑞士)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取

剪取成年C57BL/6J雄鼠0.5 cm鼠尾組織，放入1.5 mL 離心管中并分別加入500 μL鼠尾消化液和5 μL蛋白酶K，55℃水浴鍋中消化過(guò)夜。鼠尾消化液配置方法如下：取NaCl 2.93 g，SDS 2.5 g，1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)5 mL，0.5 M EDTA(pH 8.0)10 mL混勻后定容至500 mL。酚氯仿法提取基因組DNA，產(chǎn)物4℃保存。

1.3.2Sox30基因啟動(dòng)子區(qū)域SOHLH1結(jié)合位點(diǎn)分析及引物設(shè)計(jì)

針對(duì)Sox30轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp范圍內(nèi)啟動(dòng)子DNA序列使用Jasper軟件預(yù)測(cè)SOHLH1特異性結(jié)合位點(diǎn)E-box(CANNTG)，根據(jù)評(píng)分及位點(diǎn)分布設(shè)計(jì)合成引物，構(gòu)建三個(gè)啟動(dòng)子熒光表達(dá)質(zhì)粒1784 bp-Sox30-promoter、984 bp-Sox30-promoter、876 bp-Sox30-promoter，啟動(dòng)子區(qū)域PCR引物序列為Sox30-JD1784-F：5’-TCTGCTTGATATCCTTCCCTTT CA-3’，Sox30-JD1784-R：5’- GTGCGAGAACCCTGG AATCA-3’，Sox30-JD984-F：5’-TTACTCAACAGTCG GCAC-3’，Sox30-JD984-R：5’-CGAGAACCCTGGAA TCAT-3’，Sox30-JD876-F：5’- AAGCACTTCAAAGGA CAT-3’,Sox30-JD876-R：5’- CGAGAACCCTGGAA TCAT-3’。

1.3.3 PCR擴(kuò)增Sox30基因啟動(dòng)子片段

以C57BL/6J雄鼠鼠尾DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在50 μL PCR反應(yīng)總體系內(nèi)使用Q5? High-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增所需DNA片段，反應(yīng)條件：98℃ 8 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，切膠回收目的片段。

1.3.4 構(gòu)建Sox30啟動(dòng)子全長(zhǎng)和截短序列的pGL3-Sox30熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒

純化回收的DNA片段與pMD18-T Vector 16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，篩選正確連接的菌種提取質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ雙酶切所提取的Sox30質(zhì)粒DNA和pGL3-Basic質(zhì)粒載體骨架，使用TaKaRa公司說(shuō)明書提供的雙酶切體系。T4DNA連接酶反應(yīng)體系16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑菌落克隆提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序鑒定。

1.3.5 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光素酶活性

于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)16 h，匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的pGL3-Sox30啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒(0.4 μg/孔)、pcDNA3.0-Sohlh1真核表達(dá)質(zhì)粒(0.4 μg/孔)和內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒(0.008 μg/孔)按照LipofectamineTM3000實(shí)驗(yàn)手冊(cè)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

37℃、5% CO2在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將共轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞取出，棄掉96孔板中培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 1×PBS清洗細(xì)胞，棄掉PBS。根據(jù)Dual-Luciferase? Report Assay Systerm操作手冊(cè)指導(dǎo)，樣品放入M200 PRO多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性及海腎熒光素酶活性，保存數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)篩選SOHLH1結(jié)合位點(diǎn)

頸椎脫位法處死成年C57BL/6J雄鼠取雙側(cè)睪丸組織剝離出曲細(xì)精管，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)所述[10]，甲醛處理新鮮睪丸組織DNA與蛋白交聯(lián)，按照EZ-ChIPTM- Chromatin Immunoprecipitation Kit試劑盒說(shuō)明書提取SOHLH1抗體結(jié)合的DNA片段。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選出的Sox30核心啟動(dòng)子片段及SOHLH1結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)ChIP實(shí)驗(yàn)所需qRT-PCR引物(引物序列分別為ChIP-892 bp-105F：5’-ATTACTCAACAGTCGGCACTGG-3’，ChIP-892 bp-105R：5’- TGTGTGATTATTCTGCGCCTC-3’，ChIP-837 bp-177F：5’- GAGGCGCAGAATAATCAC-3’，ChIP-837 bp-177R：5’- AGGACGCTTTAGCAAG TC-3’，ChIP-449 bp-101F：5’- GGAGGTAGTGGGAC ATAG-3’，ChIP-449 bp-101R：5’- CCACCATTATCCT GCTTA-3’， ChIP-514 bp-151F：5’- GGTTTATCAG GCTCTGC-3’，ChIP-514 bp-151R：5’-TTGCTCT TCACCTATGT-3’)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pGL3-Sox30啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒

以C57BL6/J小鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度分別為1784 bp、984 bp和876 bp的啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段，雙酶切后使用T4DNA 連接酶與pGL3-Basic載體連接。質(zhì)粒DNA經(jīng)測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)，證實(shí)連入載體中的啟動(dòng)子片段與預(yù)期一致，獲得目標(biāo)序列正確連接的pGL3-Sox30-876 bp、pGL3-Sox30-984 bp和pGL3-Sox30-1784 bp質(zhì)粒。如圖1所示。

注：M：TaKaRa DL2000 Maker；孔道1：Sox30啟動(dòng)子1784 bp目的片段；孔道2：Sox30啟動(dòng)子984 bp目的片段；孔道3：Sox30啟動(dòng)子876 bp目的片段。圖1 Sox30啟動(dòng)子DNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Note. M, TaKaRa DL2000 Maker. Lane 1, Sox30 promoter 1784 bp target fragment. Lane 2, Sox30 promoter 984 bp target fragment. Lane 3, Sox30 promoter 876 bp target fragment.Figure 1 Sox30 promoter DNA sequence via PCR amplification of the electrophoresis products

2.2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對(duì)Sox30基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用

將構(gòu)建好的pGL3-Sox30啟動(dòng)子區(qū)域螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒、pcDNA3.0-Sohlh1真核表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參TK共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)不同啟動(dòng)子片段的熒光素酶活性，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較(圖2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共同轉(zhuǎn)染Sox30啟動(dòng)子熒光表達(dá)載體和pcDNA3.0-Sohlh1真核表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染pGL3-Basic空載載體的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度有不同程度增強(qiáng)，SOHLH1可以激活Sox30基因轉(zhuǎn)錄，證明該基因存在延時(shí)翻譯現(xiàn)象。共轉(zhuǎn)染了pGL-Sox30-876 bp質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組熒光活性最強(qiáng)，推測(cè)Sox30核心啟動(dòng)子片段位于區(qū)域內(nèi)。

注：誤差線代表重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差；**P<0.01。圖2 轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對(duì)Sox30基因啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用Note. Error bars represent the mean ± standard error of repeated experiments. **P<0.01.Figure 2 Transcriptional regulation of the Sox30 gene promoter sequence by the transcription factor SOHLH1

2.3 ChIP實(shí)驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1與Sox30基因啟動(dòng)子區(qū)的主要結(jié)合位點(diǎn)

ChIP實(shí)驗(yàn)中與SOHLH1抗體結(jié)合的DNA片段洗脫純化后qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。ChIP結(jié)果(見圖3)顯示SOHLH1可以結(jié)合于Sox30啟動(dòng)子片段-876 bp中-544 bp E-box (CAACTG)、-489 bp E-box(CAGGTG)、-166 bp E-box(CAACTG)、-101 bp E-box(CATATG)，這四個(gè)E-box位點(diǎn)起直接轉(zhuǎn)錄激活作用。SOHLH1與-489 bp (CAGGTG)位置E-box位點(diǎn)的結(jié)合作用較強(qiáng)，預(yù)示此位點(diǎn)為Sox30基因啟動(dòng)子上的主要轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)。

注：A：Sox30 -544 bp E-box (CAACTG) ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：Sox30 -489 bp E-box (CAGGTG) ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C：Sox30-166 bp E-box (CAACTG) ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D：Sox30 -101 bp E-box (CATATG) ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果。IgG：陰性對(duì)照；誤差線代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差；與IgG相比，**P<0.01。圖3 轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1與Sox30基因啟動(dòng)子序列上E-box位點(diǎn)的結(jié)合作用Note. A, Sox30 -544 bp E-box (CAACTG) ChIP test result. B, Sox 30-489 bp E-box (CAGGTG) ChIP test result. C, Sox30 -166 bp E-box (CAACTG) ChIP test result. D, Sox30 -101 bp E-box (CATATG) ChIP test results. IgG was the negative control. Error bars represent the mean ± standard error of three replicate experiments. Compared with IgG, **P<0.01.Figure 3 Binding of the transcription factor SOHLH1 to the E-box site on the Sox30 gene promoter sequence

3 討論

在雄性小鼠中SOHLH1蛋白特異表達(dá)于精原干細(xì)胞和A1-A4型精原細(xì)胞中，是精子發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[4]。Sox30基因編碼的SOX30蛋白具有一個(gè)HMG box結(jié)構(gòu)域，是性腺發(fā)生和精子發(fā)生中頂體形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[11-14]。本研究構(gòu)建了Sox30啟動(dòng)子熒光素酶質(zhì)粒，利用Sohlh1真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明SOHLH1對(duì)Sox30基因存在直接轉(zhuǎn)錄激活作用。并且通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證明SOHLH1結(jié)合于Sox30基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-544 bp、-489 bp、 -166 bp和-101 bp處的E-box序列對(duì)Sox30產(chǎn)生直接轉(zhuǎn)錄激活作用，并發(fā)現(xiàn)位于-489 bp (CAGGTG)位置的E-box位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1的結(jié)合作用較強(qiáng)，預(yù)示著此E-box位點(diǎn)為Sox30基因啟動(dòng)子上的主要轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)，表明精原細(xì)胞早期發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1可以直接激活精子發(fā)生相關(guān)基因Sox30的轉(zhuǎn)錄。

SOHLH1在精原細(xì)胞中表達(dá)，Sox30 mRNA在出生后4-7天雄鼠睪丸組織中可通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到，此階段的睪丸組織中只存在精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞，說(shuō)明此時(shí)Sox30 mRNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)生于這兩種細(xì)胞內(nèi)，與本研究中所證實(shí)的SOHLH1在精子發(fā)生早期直接激活Sox30基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制相符。而SOX30蛋白存在于精子發(fā)生后期的圓形精子細(xì)胞中，對(duì)頂體形成的過(guò)程起關(guān)鍵作用[14]，結(jié)合本研究的結(jié)論，說(shuō)明在精子發(fā)生的早期Sox30基因就被激活轉(zhuǎn)錄，mRNA處于翻譯抑制狀態(tài)直至圓形精子階段才啟動(dòng)翻譯。由于這兩種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及翻譯的時(shí)空特異性，推測(cè)本文所證實(shí)的SOHLH1直接調(diào)控Sox30基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制涉及了精子發(fā)生中存在的延時(shí)翻譯現(xiàn)象。在精子發(fā)生過(guò)程中，參與精子形成相關(guān)的基因甚至在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的早期如精原細(xì)胞中已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄，mRNA在細(xì)胞發(fā)育至后期時(shí)才被翻譯為蛋白質(zhì)并發(fā)揮功能[16-21]。雖然目前關(guān)于延遲翻譯現(xiàn)象的推論較多，但延遲翻譯基因的具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)證明精子發(fā)生早期精原細(xì)胞中重要轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1對(duì)圓形精子細(xì)胞頂體形成相關(guān)基因Sox30的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，豐富了精子發(fā)生中延時(shí)翻譯表達(dá)調(diào)控的現(xiàn)象，并為精原細(xì)胞延遲翻譯調(diào)控機(jī)制的研究提供了線索。