韋麗文

柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001

桑椹為?？坡淙~喬木桑樹MorusalbaL.的果實(shí)，為聚花果，由多數(shù)小瘦果實(shí)集合而成，呈長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)1～2 cm，直徑0.5～0.8 cm，黃棕色、紅棕色或暗紫色，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥的功效，用于肝腎陰虛、心悸失眠、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴、津傷口渴、腸燥便秘[1]。桑椹被普遍認(rèn)為以成熟的紫黑色者為佳，《說文》中記載，“黑葚之黑也”；《中華本草》中記載桑椹分為黃棕色、紅棕色至暗紫色，但以肉厚、紫紅色、糖性大者為佳。而現(xiàn)今對(duì)桑椹的研究也多是對(duì)紫黑色成熟果實(shí)進(jìn)行的，其藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到普遍的認(rèn)同，而對(duì)于未成熟的果實(shí)研究甚少。植物多酚是廣泛存在的一類物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血糖血脂等功效，被廣泛應(yīng)用于日常生活中[2-6]，桑椹中同樣富含多酚成分，綠原酸為桑椹多酚的重要組成成分，經(jīng)測(cè)定比較，綠原酸在桑椹成熟過程中含量變化較大，本實(shí)驗(yàn)以不同成熟度桑椹多酚為研究對(duì)象，探索其綠原酸含量與抗氧化活性在其成熟過程中的變化規(guī)律，分析其品質(zhì)差別，擴(kuò)寬桑椹資源的研究與利用。

1 材料

1.1 儀器

島津UV1800紫外可見分光光度計(jì)；超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；水浴鍋(HH-S，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；玻璃層析柱(10 mm×30 cm)；分液漏斗；移液槍(Eppendorf Research plus)。

1.2 試藥

AB-8大孔樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；鹽酸(愛廉化試劑有限公司)；氫氧化鈉(天津市博迪化工有限公司)；乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；石油醚(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；福林-酚試劑(上海荔達(dá)生物科技有限公司)；無水碳酸鈉(分析純，天津博迪化工股份有限公司)。

青、紅、黑3種不同成熟度桑椹藥材，采集于廣西南寧市蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，樣品經(jīng)廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站朱方容研究員鑒定為?？粕僦参飶V東桑MorusatropurpureaRoxb.“桑特優(yōu)二號(hào)” 的果穗。

2 桑椹多酚純化

2.1 桑椹多酚粗提物制備

取過120目篩的青、紅、黑桑椹粉末各2 g，精密稱定，共3份，分別置于100 mL具塞三角瓶中，加入50%的乙醇溶液適量，超聲提取20 min，離心取上清液，得到3種不同成熟度桑椹多酚粗提物。

2.2 桑椹多酚純化

取預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂，精密稱定，濕法上柱，用純水沖洗至流出液透明。將3種不同成熟度的桑椹多酚粗提物分別控制流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。將吸附后的AB-8大孔樹脂用少量純水沖洗，洗去可溶性雜質(zhì)至流出液澄清，后用50%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.0 mL·min-1，合并洗脫液，得桑椹3種不同成熟度多酚純化物。

3 不同成熟度桑椹多酚綠原酸含量測(cè)定

3.1 藥材

按照2項(xiàng)下制備的桑椹多酚純化物。

3.2 試劑

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201205，供含量測(cè)定用)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；冰醋酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水(美國(guó)Millipore密理博明澈TMD超純水系統(tǒng))。

3.3 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機(jī)(G1322A)、高壓四元泵(G1311A)、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329A)、智能化柱溫箱(G1316A)、二極管陣列檢測(cè)器(G1315D)、Agilent Chemistation色譜工作站；高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；超聲波清洗儀(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多AE100電子分析天平)；美國(guó)Millipore密理博明澈TMD超純水系統(tǒng)；移液槍(Eppendorf Research plus)；水浴鍋(HH-S江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)。

3.4 方法與結(jié)果

3.4.1 色譜條件 安捷倫Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸系統(tǒng)；流速為0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。洗脫程序見表1。

表1 綠原酸含量測(cè)定洗脫條件

3.4.2 對(duì)照品溶液配制 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為0.11 mg·mL-1的綠原酸溶液，即得。

3.4.3 供試品溶液配制 青、紅、黑3種不同成熟度的桑椹多酚純化物適量，精密稱定，加50%甲醇溶液分別制成相應(yīng)濃度的供試品溶液，離心，取上清液備用，得供試品溶液。

3.4.4 方法學(xué)考察

3.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取3.4.2的對(duì)照品溶液，分別稀釋為0、5、10、25、50、100倍，按3.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=46 437X-15.21，r=0.999 9；表明綠原酸質(zhì)量濃度在0.001 1～0.11 mg·mL-1線性關(guān)系良好

3.4.4.2 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.022 mg·mL-1的綠原酸對(duì)照品溶液，按按3.4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積分別為913、912.1、910.1、904.3、902.9、903.5，RSD為0.25%，符合定量分析要求。

3.4.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按3.4.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，取青桑椹多酚純化物制備成1.0 mg·mL-1的溶液，平行制備6份，按3.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算綠原酸含量，RSD=1.84%，符合定量分析要求。

3.4.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1)，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按3.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，RSD=1.26%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的青桑椹多酚純化物適量，精密稱定，配制成2.0 mg·mL-1的青桑椹多酚溶液，取0.5 mL該溶液，置于2.0 mL容量瓶，加入質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL-1的綠原酸對(duì)照品溶液0.5 mL，定容，平行6份，按3.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算綠原酸含量，測(cè)得平均回收率為97.7%，RSD為2.3%。結(jié)果見表2。

表2 綠原酸含量測(cè)定回收率考察結(jié)果(n=6)

3.4.4.6樣品測(cè)定 按3.4.3項(xiàng)下所述制備供試品溶液，青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1，紅桑椹多酚溶液2.0 mg·mL-1，黑桑椹多酚溶液5.0 mg·mL-1，按3.4.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)綠原酸峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，綠原酸對(duì)照品及樣品HPLC圖見圖1～4。

圖1 綠原酸對(duì)照品HPLC圖

圖2 青桑椹多酚綠原酸HPLC圖

圖3 紅桑椹多酚純化物綠原酸HPLC圖

圖4 黑桑椹多酚純化物HPLC圖

3.4.4.7 樣品測(cè)定結(jié)果 由表3測(cè)定結(jié)果可知，青桑椹多酚中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.8 mg·g-1，紅桑椹多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.5 mg·g-1，黑桑椹多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7 mg·g-1，由此可知，綠原酸含量排序?yàn)榍嗌ｉ┒喾蛹兓?紅桑椹多酚純化物>黑桑椹多酚純化物。

表3 不同成熟度桑椹多酚中綠原酸的含量測(cè)定數(shù)據(jù)

4 不同成熟度桑椹多酚純化物抗氧化活性

4.1 材料

4.1.1 材料 按照2項(xiàng)下制得的青、紅、黑桑椹多酚純化物。

4.1.2 儀器 分析天平BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；移液槍(Eppendorf Research plus)；水浴鍋(HH-S，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)。

4.1.3 試劑 總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、VC對(duì)照品(南京建成生物工程研究院)；冰醋酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

4.2 總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試

4.2.1 原理 抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。

4.2.2 總抗氧化實(shí)驗(yàn)與結(jié)果 取2項(xiàng)下制得的青、紅、黑桑椹多酚純化物適量，精密稱定，分別加2.0 mL純水進(jìn)行溶解，將3種成熟度的桑椹多酚純化物配制成質(zhì)量濃度為0.57 mg·mL-1的桑椹多酚溶液，將配制好的桑椹多酚純化物分別按1∶1、1∶5、1∶15、1∶25的比例稀釋，稀釋倍數(shù)分別為2、6、16、26，按照說明書的步驟方法做總抗氧化能力測(cè)試，每種稀釋濃度平行3份，并將Vc對(duì)照品也配制成0.57 mg·mL-1，作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算總抗氧化能力。運(yùn)用SPSS21.0，考察桑椹多酚稀釋倍數(shù)及成熟度雙因素對(duì)其總抗氧化能力的影響，將稀釋倍數(shù)2、6、16、26與成熟度青、黑、紅、Vc 4個(gè)水平進(jìn)行雙因素考察，結(jié)果見表4～8，由表6可以看出不同稀釋倍數(shù)、成熟度以及稀釋倍數(shù)與成熟度的交互作用對(duì)桑椹多酚總抗氧化能力影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由表7可以看出3種成熟度的桑椹多酚稀釋倍數(shù)越小，即桑椹多酚濃度越大，總抗氧化能力越強(qiáng)；而由表8可以看出不同成熟度總抗氧化能力大小為VC>青桑椹多酚>黑桑椹多酚>紅桑椹多酚。

表4 3種成熟度桑椹多酚純化物抗氧化能力測(cè)試結(jié)果

注：表中數(shù)值越大表明總抗氧化能力越強(qiáng)。

表5 3種成熟度不同稀釋倍數(shù)桑椹多酚純化物總抗氧化能力的描述統(tǒng)計(jì)

注：因變量為總抗氧化能力。

表6 3種成熟度不同稀釋倍數(shù)桑椹多酚純化物總抗氧化能力的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

表7 不同稀釋倍數(shù)桑椹多酚純化物總抗氧化能力的對(duì)比統(tǒng)計(jì)

注：數(shù)值越大，表示總抗氧化能力越強(qiáng)。

表8 3種成熟度桑椹多酚純化物總抗氧化能力對(duì)比統(tǒng)計(jì)

注：數(shù)值越大，表示總抗氧化能力越強(qiáng)。

5 討論

青、紅、黑3種成熟度桑椹多酚中均含有綠原酸，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.8、29.5、1.7 mg·g-1，由此可見，綠原酸含量在桑椹成熟過程中變化較大，桑椹成熟度越高，其綠原酸含量越低。

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，青、紅、黑3種成熟度桑椹多酚都有抗氧化活性。將同一成熟度的桑椹多酚抗氧化能力進(jìn)行比較，總抗氧化能力隨著桑椹多酚濃度的增大而增強(qiáng)；而將不同成熟度桑椹多酚抗氧化能力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，3種成熟度的桑椹多酚的總抗氧化能力次序?yàn)榍嗌ｉ┒喾?黑桑椹多酚>紅桑椹多酚，與綠原酸含量的變化并沒有直接聯(lián)系，這與桑椹多酚在成熟過程中成分變化有關(guān)，桑椹多酚中除了綠原酸外，還有如蘆丁、花青素等多種成分，同樣也具有抗氧化活性[7-8]，因此，桑椹多酚的抗氧化活性是多種成分共同作用的結(jié)果，而其中哪一種成分的抗氧化活性最強(qiáng)，且隨著桑椹成熟過程中，成分含量有著怎樣的變化還有待進(jìn)一步研究。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了大家所熟悉的黑桑椹中的多酚成分具有抗氧化活性外，青、紅桑椹多酚純化物的抗氧化活性不容小覷，這就意味著可以擴(kuò)大桑椹資源的利用，人們食用的都是成熟的黑桑椹，沒有對(duì)未成熟的桑椹進(jìn)行開發(fā)利用，那么，對(duì)于食品工業(yè)的保鮮劑、生態(tài)環(huán)境中的去污劑在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用，都可以對(duì)未成熟的桑椹多酚進(jìn)行開發(fā)利用。