吳田澤，陳露，肖煜強(qiáng)，鄒問汀，胡心怡，李宇陽，劉霞*，黃升

1.武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.恩施冬升植物開發(fā)有限責(zé)任公司，湖北 恩施 445000

莢蒾屬ViburnumLinn.植物屬五福花科Adoxaceae灌木或小喬木，分布于我國各省，尤以西南部地區(qū)種類最多，具有相當(dāng)長久的應(yīng)用觀賞歷史。同時，莢蒾屬植物一直被作為民間藥用植物，具有悠久的藥用歷史。莢蒾屬植物始載于《新修本草》，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、健脾消食、抗衰老、強(qiáng)身、驅(qū)蟲等作用，臨床可用于治療小兒疳積、小兒發(fā)育不良、婦科疾病等[1-2]。目前，莢蒾屬很多物種未得到很好的開發(fā)和利用，其中活性成分的研究仍未完全明確。因此，建立一種快速、有效的鑒別方法將為其開發(fā)利用及活性成分的研究奠定重要基礎(chǔ)。

中藥材的傳統(tǒng)鑒別方法主要有基原鑒定、形態(tài)鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等，均具有不同程度的局限性。在中藥材鑒定中，DNA條形碼鑒定相比于傳統(tǒng)中藥鑒定方法有著革命性的進(jìn)步[3-4]。DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)[5]，該DNA片段具有種間的多樣性及特異性，不受生物個體發(fā)育狀況及其形態(tài)特征所限制，可克服對經(jīng)驗鑒定的過度依賴，實現(xiàn)自動化和標(biāo)準(zhǔn)化[6-7]。中藥材DNA條形碼分子鑒定是以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列、psbA-trnH為輔助序列，主要適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末以及部分藥材飲片)及基原物種的鑒定[1，4]，并且已在野菊[8]、霍山石斛[9]、羌活[10]、冬蟲夏草[11]、枸杞子[12]等中藥材上得到驗證。

本研究旨在通過DNA條形碼分子鑒定法對莢蒾屬類不同種類藥用植物進(jìn)行鑒別研究，包括珊瑚樹、雞樹條、水紅木、煙管莢蒾等13種莢蒾屬藥用植物，建立該屬藥用植物鑒定的新方法，為其質(zhì)量控制、合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 DNA條形碼鑒定材料

本研究通過野外考察等方式收集了莢蒾屬植物13種，共32份樣品，其中水紅木Viburnumcylindricum5份，川西莢蒾V.davidii2份，細(xì)梗紅莢蒾V.erubesens1份，珍珠莢蒾V.foetidumvar.ceanothoides1份，直角莢蒾V.foetidumvar.rectangulatum1份，珊瑚樹莢蒾V.odoratissimum2份，少花莢蒾V.oliganthum1份，雞樹條V.opulusvar.calvescens3份，蝴蝶戲珠花V.plicatumvar.tomentosum2份，球核莢蒾V.propinquum5份，皺葉莢蒾V.rhytidophyllum5份，臺東莢蒾V.taitoense2份，煙管莢蒾V.utile2份，分別來自湖北、四川、云南等地。所有樣品經(jīng)中國科學(xué)院武漢植物園標(biāo)本館原館長趙子恩研究員鑒定，樣品保存在武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院中藥資源與分子鑒定實驗室。詳細(xì)樣品信息見表1。另從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載上述13個物種ITS2序列共14條。見表2。

表1 采集的莢蒾屬植物樣品信息

表2 GenBank下載序列信息表

1.2 儀器與試劑

本實驗所用儀器見表3，所用試劑見表4。

表3 DNA條形碼研究所用儀器

表4 DNA條形碼研究所用試劑

2 方法

2.1 樣品處理及DNA提取

稱取樣品的干燥葉或果實20～30 mg，用高通量組織研磨器研磨120 s(50 Hz)，核分離液(2% PVP，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol·L-1NaCl)800 μL 抽提3次，56 ℃水浴過夜，然后用三氯甲烷-異戊醇(24∶1)800 μL抽提2次。利用植物基因組DNA提取試劑盒法(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA[13]，提取完成后，用50 μL ddH2O洗脫，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ITS2序列擴(kuò)增和測序

以樣品DNA為模板，對ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物、PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序均參考陳士林研究員課題組的研究[13-14]，詳細(xì)條件見表5。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：Premi X TaqTM酶12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL，DNA模板2 μL。對擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在120 V電泳電壓下電泳20 min，利用DNA Marker判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小以及含量大小，并送至生工生物工程(上海)有限公司武漢分公司進(jìn)行雙向測序。

表5 擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件

2.3 數(shù)據(jù)處理

測序所得DNA序列峰圖，運用CodonCode Aligner V 6.0.2(Codon Code Co.，USA)軟件進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接校對，采用基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得完整的ITS2序列[15]。將所有DNA序列使用MEGA5.1處理軟件進(jìn)行保守位點、變異位點等信息的分析比對，同時基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型計算遺傳距離并分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹[16]，利用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 種內(nèi)變異分析

本研究中13種莢蒾屬藥用植物ITS2序列特征見表6。水紅木共6條序列，長度224～254 bp，48 bp處存在T-C變異，59 bp處存在A-T變異，239 bp處存在G-A變異，246 bp處存在T-C變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.1%。川西莢蒾共3條序列，長度為223～253 bp，不存在種內(nèi)變異位點；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.8%。細(xì)梗紅莢蒾共2條序列，長度為219～225 bp，不存在種內(nèi)變異位點；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.0%。珍珠莢蒾共2條序列，長度為230～254 bp，不存在種內(nèi)變異位點；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.0%。直角莢蒾共2條序列，長度為224～230 bp，75 bp處存在C-G變異，173 bp處存在C-T變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.6%。珊瑚樹莢蒾共3條序列，長度為219～225 bp，不存在種內(nèi)變異位點；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.0%。少花莢蒾共2條序列，長度為219～225 bp，不存在種內(nèi)變異位點；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.3%。雞樹條共4條序列，長度為220～251 bp，在85 bp處存在G-A變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.2%。蝴蝶戲珠花共3條序列，長度為219～249 bp，75 bp處存在C-T變異，76 bp處存在A-G變異，106 bp處存在C-T變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.9%。球核莢蒾共6條序列，長度為208～229 bp，152 bp處存在G-A變異，209 bp處存在G-A變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.3%。皺葉莢蒾共6條序列，長度為219～249 bp，在71 bp處存在T-C變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.5%。臺東莢蒾共3條序列，長度為208～249 bp，141 bp處存在C-T變異，167 bp處存在A-G變異，237 bp處存在C-T變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.6%。煙管莢蒾共3條序列，長度為219～249 bp，在70 bp處存在T-C變異；平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.2%。

表6 樣品ITS2序列特征表

3.2 K2P遺傳距離分析

利用K2P模型計算遺傳距離，ITS2序列種內(nèi)、種間平均遺傳距離見表7。結(jié)果顯示，水紅木種內(nèi)最大遺傳距離為0.014 8，小于種間最小遺傳距離0.029 8；川西莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.019 8；細(xì)梗紅莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.009 8；珍珠莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.014 8；直角莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.009 8，小于種間最小遺傳距離0.014 8；珊瑚樹莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.019 7；少花莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0，小于種間最小遺傳距離0.009 8；雞樹條種內(nèi)最大遺傳距離為0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.030 2；蝴蝶戲珠花種內(nèi)最大遺傳距離為0.019 8，小于種間最小遺傳距離0.035 4；球核莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.009 8，小于種間最小遺傳距離0.019 8；皺葉莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.014 7；臺東莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.014 7，小于種間最小遺傳距離0.014 9；煙管莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.004 9，小于種間最小遺傳距離0.014 7。13種莢蒾屬植物樣本種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離，表明ITS2序列作為條形碼基本可將莢蒾屬藥用植物從種水平上分開。各物種間遺傳距離為0.009 8～0.119 1，其中少花莢蒾與細(xì)梗紅莢蒾種間遺傳距離最近，臺東莢蒾和雞樹條種間遺傳距離最遠(yuǎn)。

表7 13種莢蒾屬藥用植物種內(nèi)和種間遺傳距離

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)分析

基于ITS2序列對13種莢蒾屬藥用植物構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap 1000次檢驗各分支置信度，各分支置信度均大于50%，見圖1。圖中水紅木以89%置信度聚為一支；雞樹條以99%置信度聚為一支；珍珠莢蒾以85%置信度聚為一支；直角莢蒾以55%置信度聚為一支；川西莢蒾以83%置信度聚為一支；球核莢蒾以94%置信度聚為一支；煙管莢蒾以90%置信度聚為一支；皺葉莢蒾以75%置信度聚為一支；蝴蝶戲珠花以95%置信度聚為一支；少花莢蒾以66%置信度聚為一支；細(xì)梗紅莢蒾以65%置信度聚為一支；珊瑚樹莢蒾以90%置信度聚為一支；臺東莢蒾以92%置信度聚為一支。每種莢蒾屬植物均呈現(xiàn)良好的單系性，可從NJ樹得到各個物種之間的進(jìn)化和親緣關(guān)系。由此可見，利用ITS2序列作為條形碼可將莢蒾屬植物分開。

4 討論

莢蒾屬植物多為灌木或小喬木，花序為聚傘花序組成的復(fù)傘形花序或圓錐花序，小花繁多，白色，果實成熟時為紫紅色，具有極高觀賞價值。該屬植物在全世界約230多種，亞洲、南美洲種類較多。我國有74種，其中具有藥用價值的種類已達(dá)43種，其中以枝入藥的有11種，以根莖入藥的有11種，以根、莖、葉入藥的有4種，以根、果入藥的有8種，以根、莖、葉及花果入藥的有9種[16]。莢蒾屬植物藥用活性成分包括綠原酸、黃酮類、熊果酸、酚類、乙酰膽堿酶、β-谷甾醇等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗病毒、降低血脂和血糖等功能[2，17-20]。

4.1 ITS2序列鑒定方法

莢蒾屬植物物種類型多樣，由于其植物形態(tài)的相似性、遺傳關(guān)系的復(fù)雜性，因此鑒定莢蒾屬植物是一個難題。劉震等[21]對忍冬科藥用植物DNA條形碼通用序列的篩選實驗中，利用ITS2序列成功完全區(qū)分開6個莢蒾屬近緣種，為本實驗莢蒾屬物種鑒別提供了一定指導(dǎo)依據(jù)。

在本實驗中，13種莢蒾屬植物提取到高質(zhì)量ITS2序列的成功率為100%，ITS2序列的種內(nèi)變異均較小，具有良好的穩(wěn)定性。13種莢蒾屬植物ITS2序列種內(nèi)最大遺傳距離均小于種間最小遺傳距離；將所有樣品的ITS2序列基于以鄰接法、最大簡約法、最大似然法估計構(gòu)建NJ樹的結(jié)果表明，各種莢蒾屬植物均獨自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。證實ITS2條形碼序列能準(zhǔn)確鑒別莢蒾屬藥用植物。綜上所述，ITS2序列可用于莢蒾屬藥用植物的鑒定，是基于分子條形碼技術(shù)鑒定的理想序列。

注：Bootstrap 1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。圖1 樣品ITS2序列構(gòu)建的13種莢蒾屬植物的NJ系統(tǒng)聚類樹

4.2 研究展望

本實驗主要研究了我國分布在四川、湖北等地的川西莢蒾、皺葉莢蒾、珊瑚樹莢蒾等品種，還有許多莢蒾屬其他品種沒有進(jìn)行全面采集研究，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品量來驗證鑒定體系的精密性與有效性。

本研究通過ITS2序列鑒定，可以確切鑒定物種是否為莢蒾屬植物，并且可以初步確定被測樣品物種，為后續(xù)的莢蒾屬鑒定體系鑒定發(fā)展打下了堅實的基礎(chǔ)。在后續(xù)的研究中，可以在本研究采用的ITS2序列的基礎(chǔ)上，使用psbA-trnH、rbcL、matK等其他DNA條形碼序列進(jìn)行延伸研究和輔助驗證。從而構(gòu)建更加準(zhǔn)確、快速的莢蒾屬植物DNA條形碼鑒定體系，并輔以傳統(tǒng)的鑒定方法，為莢蒾屬植物鑒定提供有力的方法。

5 總結(jié)

本研究通過莢蒾屬植物樣品DNA提取、ITS2序列和psbA-trnH序列擴(kuò)增、DNA條形碼測序以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定了莢蒾屬植物種間鑒定體系，不僅可以初步進(jìn)行莢蒾屬植物鑒定，為日后更加準(zhǔn)確、快速地鑒定莢蒾屬植物打下堅實的基礎(chǔ)，從而更好地進(jìn)行莢蒾屬植物的開發(fā)與利用研究。