楊波，董輝，孫暉，韓瑩，張愛華，閆廣利，王喜軍

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效，中醫(yī)臨床常用于治療亡陽虛脫、肢冷脈微、心陽不足等癥[1]。但附子有大毒，使用不當(dāng)則容易造成不同程度的心臟、神經(jīng)和胚胎等方面的毒性反應(yīng)，甚至危及生命。因此，附子及含有附子的中藥制劑的安全性遭到質(zhì)疑。然而，中醫(yī)自古就采用方劑配伍的方法對(duì)附子進(jìn)行處理，從而達(dá)到“減毒增效”之功，附子與甘草配伍就是常用藥對(duì)之一。近年來，中醫(yī)藥工作者對(duì)附子及附子甘草藥對(duì)開展了大量的研究，從配伍前后的化學(xué)成分[2-6]、藥效[7-8]和毒性[9-10]等方面對(duì)二者的配伍優(yōu)勢進(jìn)行了闡釋。然而，附子的毒性本質(zhì)尚不明確，附子配伍甘草的減毒作用機(jī)制研究尚不深入，這極大地制約了附子的臨床使用和相關(guān)藥物的研發(fā)。代謝組學(xué)是以動(dòng)物的體液、組織和細(xì)胞等為研究對(duì)象，監(jiān)測生物體對(duì)生理、病理或藥物刺激產(chǎn)生的代謝物及其質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化。作為毒性評(píng)價(jià)手段，代謝組學(xué)可觀察機(jī)體毒性的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)全過程，能客觀反映內(nèi)源性代謝物組的整體變化，因此代謝組學(xué)系統(tǒng)策略已被廣泛應(yīng)用到了中藥的毒性評(píng)價(jià)中[11-15]。本研究采用代謝組學(xué)方法對(duì)附子毒性及附子配伍甘草后的減毒作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，從毒性生物標(biāo)記物角度闡釋附子甘草藥對(duì)的減毒作用機(jī)理，為附子的臨床用藥安全提供依據(jù)，也為附子甘草相關(guān)藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀、Waters SynaptTM High Definition MS(HDMS/MS)System質(zhì)譜儀、MassLynx V4.1工作站(Waters集團(tuán)公司，美國)；KDC-160HR型高速低溫離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；Milli-Q Academic 水純化系統(tǒng)(Millipore中國有限公司)；PB1501-N型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

附子于2017年7月采自四川省綿陽市安縣沸水鎮(zhèn)勝利村，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室孟祥才研究員鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根；甘草購自北京同仁堂哈爾濱藥店。

亮氨酸腦啡肽(Leucine-enkephalin，Sigma技術(shù)有限公司，美國)；乙腈為色譜純(Merck技術(shù)有限公司，德國)；甲醇為色譜純(Merck技術(shù)有限公司，德國)；甲酸為色譜純(科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙酸為色譜純(科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料公司)。

2 方法

2.1 給藥樣品的制備

取附子300 g、附子300 g+甘草300 g，分別加10倍量蒸餾水浸泡1 h，煎煮90 min，過濾，濾渣再加8倍量蒸餾水煎煮60 min，濾過，合并兩次濾液，冷凍干燥，計(jì)算出粉率。將附子、附子甘草藥對(duì)凍干粉按所需生藥量用蒸餾水配置成溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，許可證號(hào)：SCXK(黑)2018012，飼養(yǎng)于溫度(24±2)℃、濕度65%～75%、12 h晝夜交替的環(huán)境中，自由飲食飲水。將大鼠隨機(jī)分為3組，分別為附子組、附子-甘草組和空白對(duì)照組。給藥劑量以生藥質(zhì)量/體質(zhì)量計(jì)，附子組給藥劑量為0.216 g·(100 g)-1，附子-甘草組給藥劑量為0.432 g·(100 g)-1，空白對(duì)照組給予相應(yīng)體積的蒸餾水，適應(yīng)1周后開始給藥，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6個(gè)月。

2.3 生物樣品的采集與制備

實(shí)驗(yàn)周期最后1天收集各組大鼠尿液樣品，在4 ℃下以13 000 r·min-1離心15 min，取上清液，供UPLC-HDMS分析；尿液樣品收集后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，摘取心、肝、脾、肺、腎，蒸餾水洗凈殘血，以10%福爾馬林溶液固定24 h后，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片，展平，脫蠟，HE染色，脫水，封片，供光學(xué)顯微鏡下各組織病理學(xué)觀察使用。

2.4 代謝組學(xué)研究分析方法

2.4.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

2.4.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters集團(tuán)公司，美國)；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈；柱溫：45 ℃；流速：0.5 mL·min-1；梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.4.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，在正、負(fù)(ESI+、ESI-)兩種模式下采集數(shù)據(jù)。毛細(xì)管電壓2.5 kV；樣品錐孔電壓50 V；提取錐孔電壓4.0 V；脫溶劑氣溫度300 ℃；脫溶劑氣流量500 L·h-1；質(zhì)量掃描范圍50～900 Da，以centriod 模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.4.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理 將大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息獲取。進(jìn)一步利用EZinfo軟件模塊對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)，觀察各組間代謝輪廓差異；為了更有效地找到差異代謝物，再對(duì)各組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)，獲得能夠直觀反映組間代謝差異貢獻(xiàn)率的VIP-plot圖。將VIP值>1且P<0.05的生物標(biāo)記物作為與附子毒性高度相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物，通過HMDB、KEGG和MetPA等數(shù)據(jù)庫檢索，確定這些毒性生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)及相關(guān)代謝通路。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 組織病理學(xué)研究

組織病理學(xué)光鏡觀察結(jié)果顯示，在給藥第6個(gè)月時(shí)，附子組大鼠心臟出現(xiàn)明顯病理改變，表現(xiàn)為心肌纖維斷裂、溶解，周圍炎性細(xì)胞浸潤，心肌萎縮，水腫等，見圖1；肝臟出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清、肝索紊亂、氣球樣變性、局部灶性壞死，見圖2；而附子-甘草組與空白對(duì)照組各臟器均未見明顯病理改變，見圖3～5。此結(jié)果表明，附子單獨(dú)給藥第6個(gè)月時(shí)對(duì)大鼠的心臟、肝臟產(chǎn)生了明顯的毒性作用，而附子配伍甘草后毒性明顯降低。

注：A.空白對(duì)照組；B.附子組；C.附子-甘草組。圖1 各組大鼠心臟組織病理學(xué)切片(HE，×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.附子組；C.附子-甘草組。圖2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)切片(HE，×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.附子組；C.附子-甘草組。圖3 各組大鼠脾臟組織病理學(xué)切片(HE，×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.附子組；C.附子-甘草組。圖4 各組大鼠肺臟組織病理學(xué)切片(HE，×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.附子組；C.附子-甘草組。圖5 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)切片(HE，×400)

3.2 代謝組學(xué)研究

對(duì)給藥第6個(gè)月的附子組、附子-甘草組及空白對(duì)照組大鼠尿液代謝輪廓進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖6所示，附子-甘草組與空白對(duì)照組代謝輪廓接近，甚至有部分交叉，而附子組與二者距離較遠(yuǎn)。此結(jié)果表明，在給藥第6個(gè)月時(shí)，附子組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝紊亂，代謝輪廓發(fā)生明顯偏移，而附子與甘草配伍后可有效調(diào)節(jié)這些發(fā)生擾動(dòng)的代謝物，使其表達(dá)水平接近正常值。結(jié)合組織病理學(xué)觀察結(jié)果，可以確定給藥第6個(gè)月時(shí)附子已經(jīng)對(duì)大鼠造成了明顯的毒性作用。為了有效地找到與附子毒性相關(guān)的內(nèi)源性代謝物，進(jìn)一步對(duì)附子組和空白對(duì)照組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，獲得能夠直觀反映附子組與空白對(duì)照組間代謝差異貢獻(xiàn)率的VIP-plot圖(見圖7)。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選VIP值>1且P<0.05的差異代謝物，通過HMDB、KEGG和MetPA等數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行檢索，結(jié)合MS/MS數(shù)據(jù)信息，最終確定了12個(gè)差異代謝物，即與附子毒性相關(guān)的生物標(biāo)記物(見表2)，同時(shí)找到了與之相關(guān)的6條代謝通路(見圖8)。以這12個(gè)與附子毒性相關(guān)的生物標(biāo)記物為切入點(diǎn)，比較其在各組間的表達(dá)差異。結(jié)果如圖9所示，附子配伍甘草后對(duì)除了黃豆黃苷和環(huán)腺苷酸以外的其他10個(gè)毒性標(biāo)記物均有不同程度的回調(diào)；推測附子配伍甘草后的減毒作用主要與其對(duì)戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換，淀粉和蔗糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝通路的調(diào)控有關(guān)。

注：A.正離子模式；B.負(fù)離子模式。圖6 附子組(FZ)、附子-甘草組(FG)及空白對(duì)照組(KB)大鼠尿液PCA分析Scores plot圖

注：A.正離子檢測模式，B.負(fù)離子檢測模式；表示VIP值>1且P<0.05的生物標(biāo)記物。圖7 附子組與空白對(duì)照組尿液樣品VIP散點(diǎn)圖

4 討論

本研究采用代謝組學(xué)方法對(duì)附子組、附子-甘草組和空白對(duì)照組大鼠尿液代謝輪廓進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)附子對(duì)大鼠尿液代謝物組產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，造成附子組大鼠代謝輪廓偏移；而附子與甘草配伍給藥后可將發(fā)生擾動(dòng)的代謝物糾正至正常水平，使附子-甘草組大鼠代謝輪廓向空白對(duì)照組方向回調(diào)。通過對(duì)給藥第6個(gè)月的附子組與空白對(duì)照組代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及質(zhì)譜信息，最終確定了12個(gè)與附子毒性相關(guān)的生物標(biāo)記物。環(huán)磷腺苷是一種嘌呤核苷酸，在人體內(nèi)具有廣泛的生理活性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、破骨細(xì)胞分化、黏蛋白和細(xì)胞因子產(chǎn)生等方面都起到了重要作用[16]。環(huán)磷腺苷能改變細(xì)胞膜的功能，促使鈣離子進(jìn)入心肌纖維，從而增強(qiáng)心肌收縮，并可促進(jìn)呼吸鏈氧化酶的活性，改善心肌缺氧。3-甲基二氧吲哚是色氨酸的代謝產(chǎn)物，色氨酸代謝異常與心臟疾病相關(guān)[17-18]。5-L-谷?；；撬崾桥；撬嵩讦?谷?；D(zhuǎn)肽酶作用下產(chǎn)生的代謝物，有報(bào)道稱?；撬崴阶兓c心臟疾病有關(guān)[19-20]。3-氧十六烷酸是脂肪酸生物合成的中間體，有研究證明脂肪酸代謝紊亂與心房纖顫有關(guān)[21]。本研究中，大鼠給予附子后，尿中環(huán)磷腺苷、3-氧十六烷酸的含量降低，而3-甲基二氧吲哚、5-L-谷?；；撬岷可?，說明附子對(duì)大鼠心臟造成了毒性反應(yīng)。在肝臟中，葡萄糖醛酸通過糖苷鍵與潛在的親脂性毒性物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生水溶性較強(qiáng)的物質(zhì)經(jīng)腎臟排出體外。這種酸化作用是評(píng)價(jià)肝臟清除有毒物質(zhì)或藥物能力的指標(biāo)。本研究中，大鼠灌胃附子后，5-羥基-6-甲氧吲哚葡萄糖苷酸、3-吲哚羧酸葡萄糖苷酸和棕櫚酰葡萄糖苷酸含量明顯降低，說明附子影響了肝臟的解毒功能。7-脫氫孕烯醇酮是性腺激素和腎上腺皮質(zhì)類固醇的前體物質(zhì)。有研究表明，機(jī)體內(nèi)孕烯醇酮含量變化與肝臟疾病(如脂肪肝)有關(guān)[22]。4，6-二羥基喹啉是5-羥色胺代謝的產(chǎn)物，4，6-二羥基喹啉水平異常與肝損傷有關(guān)[23]。L-苯丙氨酰-L-羥脯氨酸是羥脯氨酸水解的產(chǎn)物，尿液中羥脯氨酸表達(dá)異常與肝損傷有關(guān)[24]。本研究中，附子組大鼠尿中7-脫氫孕烯醇酮含量升高，而4，6-二羥基喹啉、L-苯丙氨酰-L-羥脯氨酸含量均降低，說明附子對(duì)大鼠肝臟產(chǎn)生了毒性作用。腺苷酸琥珀酸酶缺乏可導(dǎo)致腺嘌呤基琥珀酸在體液內(nèi)堆積，而腺苷酸琥珀酸酶在體內(nèi)的水平與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予附子后，尿液中腺嘌呤基琥珀酸含量升高，表明附子對(duì)大鼠體內(nèi)腺苷酸琥珀酸酶正常水平產(chǎn)生了影響，推測可能產(chǎn)生了神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。此外，黃豆黃苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化成黃豆黃素，黃豆黃素能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧。大鼠給予附子后，尿中黃豆黃苷的含量降低，表明附子還可對(duì)大鼠的腸道菌群產(chǎn)生影響。值得注意的是，本研究中附子與甘草配伍后，大鼠尿液中大部分毒性生物標(biāo)記物均有明顯回調(diào)趨勢，其含量接近正常水平；而且附子甘草組大鼠心臟、肝臟也未見明顯病理改變。此結(jié)果說明，附子甘草配伍能夠有效調(diào)節(jié)戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換，淀粉和蔗糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝通路的關(guān)鍵酶；從而達(dá)到減毒的效果。此外，有研究表明，附子與甘草配伍前后的提取物中雙酯型生物堿和單酯型生物堿的數(shù)量和含量均發(fā)生明顯改變[26-27]，而且二者配伍能夠延長雙酯型生物堿在體內(nèi)的滯留時(shí)間，從而降低由于雙酯型生物堿吸收過快而造成毒性反應(yīng)[28]。由此推測，附子甘草配伍后對(duì)毒性生物標(biāo)記物的回調(diào)可能與配伍后化學(xué)成分及體內(nèi)過程的變化有關(guān)。

圖8 MetPA代謝通路分析

表2 附子毒性相關(guān)生物標(biāo)記物結(jié)構(gòu)鑒定信息表

注：A.4，6-二羥基喹啉；B.5-L-谷?；；撬?；C.7-脫氫孕烯醇酮；D.黃豆黃苷；E.3-吲哚-羧酸葡萄糖苷酸；F.3-甲基二氧吲哚；G.L-苯丙氨酰-L-羥脯氨酸；H.腺嘌呤基琥珀酸；I.環(huán)腺苷酸；J.3-氧代十六烷酸；K.5-羥基-6-甲氧吲哚葡萄糖苷酸；M.棕櫚酰葡萄糖苷酸；與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與附子組相比，##P<0.01。圖9 附子組(FZ)、附子-甘草組(FG)和空白對(duì)照組(KB)中生物標(biāo)記物表達(dá)水平

綜上所述，本研究從代謝組學(xué)角度對(duì)附子與甘草配伍的減毒作用進(jìn)行了研究，確定了與附子毒性相關(guān)的生物標(biāo)記物，并對(duì)附子甘草藥對(duì)的減毒作用機(jī)制進(jìn)行了探討，佐證了中藥配伍減毒的科學(xué)性，為附子的臨床用藥安全提供依據(jù)，也為附子甘草藥對(duì)的相關(guān)藥物的研發(fā)提供參考。