晏玉奎 孫曉燕 鈕富榮

[摘要] 目的 探討AD患者認(rèn)知功能障礙及其嚴(yán)重程度與淋巴細(xì)胞DNA端粒長度的關(guān)系。方法 方便采集2005年1月—2018年4月該院就診的82例AD患者的臨床資料，進(jìn)行MMSE、CDR及MoCA量表評(píng)分，并采集AD患者外周血，RT-PCR法測(cè)定DNA端粒長度，Kaplan-Meier法分析AD患者疾病嚴(yán)重程度與DNA端粒長度的關(guān)系。結(jié)果 輕中度CDR、MMSE評(píng)分患者較重度患者，其生存函數(shù)時(shí)間長，模擬DNA端粒長度具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有輕中度MoCA量表評(píng)分的AD患者較重度患者，其生存函數(shù)時(shí)間長，模擬DNA端粒長度同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank=1.28，P=0.005）。結(jié)論 AD患者外周血淋巴細(xì)胞DNA端粒長度與認(rèn)知功能具有一定的量變關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] AD患者;DNA端粒長度;認(rèn)知功能

[中圖分類號(hào)] R749.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）04（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between cognitive dysfunction and telomere length of lymphocyte DNA in AD patients . Methods The clinical data of 82 AD patients were collected from January 2005 to April 2018. The MMSE， CDR and MoCA scales were scored， the peripheral blood of AD patients were convenient collected， and the length of DNA telomeres was determined by RT-PCR. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the severity of disease and DNA telomere length in AD patients. Results Compared with the patients， who had severe CDR and MMSE scores， the patients with mild to moderate MMSE and CDR scores had long survival function time， and simulated DNA telomere length had statistical differences（Log-Rank=1.82， P=0.006; Log-Rank=1.46， P=0.004）. Compared AD patients， who had severe MoCA scale score， the patients with mild to moderate MoCA scale score had long survival function time， and simulated DNA telomere length also had statistical differences （Log-Rank=1.28， P=0.005）. Conclusion There is a quantitative relationship between DNA telomere length of peripheral blood lymphocyte and cognitive function of patients with AD.

[Key words] AD patient; DNA telomere length; Cognitive function

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD） 是最常見的癡呆類型，屬于神經(jīng)退行性疾病的一種，其臨床特點(diǎn)是嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，判斷力、定向力及語言功能的下降等[1]。年齡是AD的高危因素，但兩者之間的關(guān)系仍不清。端粒是細(xì)胞老化過程中的關(guān)鍵元件，一旦端?？s短到一定的程度，細(xì)胞分裂將會(huì)停止，細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，因此，端粒在人體中充當(dāng)“分子鐘”的作用，在正常軀體細(xì)胞中，端粒隨年齡增長而縮短，并呈線性關(guān)系，此現(xiàn)象已在人類外周血細(xì)胞中觀察到，而且近期研究發(fā)現(xiàn)端粒-端粒酶系統(tǒng)的穩(wěn)定與人類的衰老及相關(guān)疾病如AD有密切關(guān)系[2]。然而，對(duì)于AD患者認(rèn)知功能障礙及其嚴(yán)重程度與淋巴細(xì)胞DNA端粒長度的關(guān)系尚未報(bào)道，因此方便選取2005年1月—2018年4月就診于該院癡呆中心的AD患者82例為研究對(duì)象，初步分析確診AD患者與外周血淋巴細(xì)胞DNA端粒長度的關(guān)系，試圖為揭示該病發(fā)病機(jī)制提供一些線索。

1? 對(duì)象與方法

1.1? 研究對(duì)象

所有病例方便選自該院癡呆中心，共82例患者，年齡68～91歲，平均（68.3±15.3）歲;所有患者均緩慢起病，就診時(shí)平均時(shí)間為28個(gè)月（9～65）月，納入標(biāo)準(zhǔn)：由至少2名有經(jīng)驗(yàn)的神經(jīng)科專科醫(yī)師診斷為臨床很可能的AD，AD的診斷依據(jù)為修訂版美國國立神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中研究所-阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（NINCDS-ADRDA）標(biāo)準(zhǔn)。該研究經(jīng)過該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到所有家屬或患者的知情同意。

1.2? 認(rèn)知量表測(cè)定

所有AD患者均由?？漆t(yī)師進(jìn)行臨床癡呆評(píng)定量表（CDR）、簡易精神狀態(tài)檢查（MMSE）和蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（MoCA）中文版，其中CDR分為輕度（CDR評(píng)分=1分）、中度（CDR評(píng)分=2分）和重度（CDR評(píng)分=3分），MMSE量表包括5部分：定向力、即刻記憶、計(jì)算力、短時(shí)記憶及語言能力，根據(jù)文化程度得分判斷：文盲≤17分，小學(xué)≤20分，初中及以上≤24分存在認(rèn)知障礙，得分越低越嚴(yán)重。MoCA量表包括：注意力和集中，執(zhí)行功能，記憶力，語言能力，視空間，抽象思維，計(jì)算，以及定向力。每份MoCA量表限制在10分鐘內(nèi)完成，總分為30分，≥26分為正常，得分越低說明癡呆越嚴(yán)重。

1.3? 外周血淋巴細(xì)胞DNA端粒長度測(cè)定

從肝素抗凝5 mL外周血中分離T、B淋巴細(xì)胞，分離過程按制造商說明，分離純度要求達(dá)到95%以上。按Rufer描述的方法，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定，染色使用碘化乙胺（PI）（Sigma公司），端粒雜交采用0.3 ug/mL端粒特異FITC共軛粒酸肽探針（FITC為異硫氰酸熒光素）（Biosystem公司），熱變性在Thermomixer上進(jìn)行（Sigma公司），由FACScan 軟件進(jìn)行分析，實(shí)際熒光強(qiáng)度通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，獲得端粒末端長度。采用羅氏公司端粒長度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)外周血細(xì)胞端粒長度（TAGGG序列），由于端粒沒有特異性酶切位點(diǎn)，基因組DNA采用限制性內(nèi)切酶的混合酶切法，于0.8%瓊脂糖凝膠5 V/cm電泳4 h后，將凝膠變性、中和，以虹吸印跡法將DNA轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜上，烘烤20 min;42℃預(yù)雜交1 h后，加入地高辛標(biāo)記的端粒探針雜交3 h;洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，所得光片經(jīng)光密度掃描成像，采用端粒長度分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算各樣本端粒長度。

1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。為了探索線粒體DNA拷貝數(shù)，端粒長度與受試者認(rèn)知臨床性狀之間的相關(guān)性，我們采用Kaplan-Meier分析生存函數(shù)相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，取雙側(cè)檢驗(yàn)。

2? 結(jié)果

2.1? 不同程度癡呆患者的臨床比較

該研究共收集82例不同程度癡呆患者，均按要求完成神經(jīng)心理測(cè)評(píng)，根據(jù)癡呆評(píng)定量表分值（CDR）發(fā)現(xiàn)有輕度患者18例，中度患者34例，嚴(yán)重患者30例。根據(jù)CDR評(píng)分，其中輕、中度患者52例，重度患者30例，其MMSE評(píng)分和MoCA量表得分見表1。

2.2? 不同臨床癡呆評(píng)定量表分值（CDR）與端粒長度的關(guān)系

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同臨床癡呆評(píng)定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度CDR的不同時(shí)間生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Log-Rank=1.82，P=0.006。

圖1 輕中度AD患者（1分、2分）患者與重度AD患者（3分患者），其中曲線1表示輕中度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3? 不同程度癡呆患者簡易精神評(píng)定量表分值（MMSE）與端粒長度的關(guān)系比較

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同臨床癡呆評(píng)定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度患者的不同時(shí)間生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Log-Rank=1.46，P=0.004。

圖2? ?輕中度MMSE得分患者與重度MMSE得分AD患者，其中曲線1表示輕中度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4? 不同程度癡呆患者M(jìn)oCA量表得分與端粒長度的關(guān)系比較

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同MoCA評(píng)定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度MoCA分值的不同時(shí)間生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank=1.28，P=0.005）。

圖3? ?輕中度MoCA得分患者與重度MoCA得分AD患者，其中曲線1表示輕度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu) ，由富含G的DNA重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白組成，對(duì)于維持染色體穩(wěn)定性具有十分重要的意義，端粒長度決定細(xì)胞的壽命，端粒隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短，與衰老如癡呆和癌變有密切的關(guān)聯(lián)。 因此，端粒長度縮短被認(rèn)為是老化的生物標(biāo)記。2009年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者就是在端粒的研究方面具有突出貢獻(xiàn)，目前有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)其與年齡相關(guān)疾病如癡呆之間有關(guān)聯(lián)，隨著全球人口老齡化趨勢(shì)加重以及分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，老年癡呆的檢出率逐漸增高，而對(duì)端粒及其長度研究的不斷深入，AD與端粒之間的聯(lián)系也會(huì)逐漸清晰[3]。

正是由于端粒長度與衰老與認(rèn)知障礙有密切關(guān)系，有研究者認(rèn)為端粒長度可以預(yù)測(cè)健康、疾病及衰老死亡。郭令軍等分別提取不同年齡組的外周血DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)40～49 歲組的白細(xì)胞端粒（1.5±0.87）kb 長于 60～69 歲組（0.8±0.16）kb（P<0.05），認(rèn)為隨著年齡增加即使是健康人，其外周血白細(xì)胞的端粒也在縮短[4]，也有研究者發(fā)現(xiàn)，年齡與端粒相對(duì)長度呈負(fù)相關(guān)，而且運(yùn)動(dòng)能力及耐力可以反應(yīng)端粒相對(duì)長度的變化，對(duì)人體抗衰老和認(rèn)知障礙有積極的促進(jìn)作用[5]。

以上研究證實(shí)在正常的衰老過程中，端粒長度變?cè)谏硇岳匣邪缪葜匾巧?，在疾病狀態(tài)中，相關(guān)研究等在對(duì)65歲以上老年人的長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，隨訪期間死亡者有較短的端粒長度;并且與無癡呆者比較，期間發(fā)展為癡呆者也有顯著較短的端粒長度，提示縮短的外周血白細(xì)胞端粒長度與癡呆的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率相關(guān)（P<0.05），是早發(fā)癡呆的危險(xiǎn)因素[6]。有關(guān)學(xué)者的研究也顯示，AD組外周血細(xì)胞端粒長度（1.4±0.67）kb顯著短于健康對(duì)照組（1.8±0.44）kb（t=11.23，P<0.05），而輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）組（1.7±0.32）kb與健康對(duì)照組（1.8±0.44）kb無差別（t=0.92，P>0.05），提示AD病理改變可能進(jìn)一步加速端粒長度的縮短[7]。本研究通過Kaplan-Meier生存函數(shù)，分析輕、中度與重度AD患者端?？s短的模擬時(shí)間函數(shù)，發(fā)現(xiàn)輕中度CDR、MMSE評(píng)分患者較重度患者，其生存函數(shù)時(shí)間顯著延長，模擬DNA端粒長度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有輕中度MoCA量表評(píng)分的AD患者較重度患者，其生存函數(shù)時(shí)間顯著延長，模擬DNA端粒長度同樣差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank=1.28，P=0.005），與上述不同認(rèn)知功能障礙患者為研究對(duì)象，其結(jié)果一致。AD的認(rèn)知功能下降與抑郁癥有密切關(guān)系，有國內(nèi)學(xué)者撰文發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者外周血淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+、CD20+）的DNA端粒長度明顯比對(duì)照組縮短（t=6.21，P<0.05）[8]，而該研究利用多元統(tǒng)計(jì)，模擬從不同認(rèn)知功能障礙程度闡述端粒時(shí)間-速度函數(shù)變化關(guān)系，認(rèn)為輕中度AD患者較重度AD患者的端粒衰減速度減慢或者具有較長的DNA端粒，進(jìn)一步說明癡呆與端粒長度縮短有一定量變關(guān)系。

也有證據(jù)顯示在認(rèn)知功能不同的AD患者中，對(duì)比外周血端粒長度后發(fā)現(xiàn)，輕度認(rèn)知障礙組轉(zhuǎn)變?yōu)锳D組的端粒長度與健康對(duì)照組無明顯差異，而穩(wěn)定輕度認(rèn)知障礙患者的端粒長度反而短，提示AD發(fā)生中的病理過程可能不是由正常生理老化來驅(qū)動(dòng)[9]。由此可見，衰老、端粒長度與AD這三者之間關(guān)系復(fù)雜。但是，端粒長度與衰老關(guān)系，反映人的衰老指標(biāo)越來越被重視，積極尋找各種類型生物學(xué)標(biāo)志物，是當(dāng)今認(rèn)知障礙研究領(lǐng)域迫切面臨且需要解決的問題，端粒長度研究在這方面已經(jīng)具有優(yōu)勢(shì)，該研究還需要進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2019-01-23）