編譯 張茜

迄今為止，最大的人工合成基因組已經(jīng)完成，其氨基酸編碼密碼子的數(shù)量比通常要少。這提高了編碼含有非自然氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的可能性。

圖1 大腸桿菌的通用圖片，研究人員重新設(shè)計(jì)了該生物的遺傳密碼

在過(guò)去的10年中，化學(xué)合成DNA成本的降低和DNA片段組裝方法的改進(jìn)使得科研人員能夠?qū)⒑铣缮飳W(xué)的規(guī)模擴(kuò)大到產(chǎn)生整個(gè)染色體和基因組的水平。之前，合成DNA已經(jīng)構(gòu)建了多達(dá)100萬(wàn)堿基對(duì)，尤其是一組來(lái)自釀酒酵母的染色體和支原體分枝桿菌的多個(gè)版本的基因組?，F(xiàn)在，朱利葉斯·福萊頓斯（Julius Fredens）等人在《自然》雜志上發(fā)表文章，報(bào)道了一個(gè)有著400萬(wàn)堿基對(duì)的大腸桿菌基因組合成版本的完成。劍橋大學(xué)分子生物學(xué)家賈森·秦（Jason Chin）是這篇論文的通信作者。這是合成基因組學(xué)新興領(lǐng)域的一個(gè)里程碑，并最終將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的主力細(xì)菌。

合成基因組學(xué)為理解生命規(guī)律提供了一種新方法，同時(shí)也將合成生物學(xué)推向了一個(gè)可以編寫(xiě)基因組進(jìn)行設(shè)計(jì)的未來(lái)。該領(lǐng)域的先驅(qū)——馬里蘭州羅克維爾市克雷格·文特爾研究所的科研人員——已經(jīng)使用這種方法更好地定義了獨(dú)立生存的細(xì)胞所需的最小基因集。通過(guò)采用計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)基因組片段、化學(xué)合成片段并進(jìn)行組裝的方法，先驅(qū)者們成功地將分枝桿菌基因組的大小縮減了大約50%。根據(jù)以往對(duì)大腸桿菌的研究表明，僅僅使用基因組編輯工具進(jìn)行同樣的操作將會(huì)更加費(fèi)力：基因刪除法最多只能刪除基因組的15%。

福萊頓斯和他的同事們利用大腸桿菌的這種簡(jiǎn)化版基因組作為合成基因組的模板，同時(shí)也考慮了另一種最小化——密碼子簡(jiǎn)化。遺傳密碼存在固有的冗余：共有64個(gè)密碼子（3個(gè)一組的“字母”或堿基），卻只能編碼20個(gè)氨基酸，再加上標(biāo)記蛋白質(zhì)編碼序列開(kāi)始和結(jié)束的起始密碼子和終止密碼子。這種冗余意味著，例如，有6個(gè)編碼絲氨酸的密碼子，以及3個(gè)可能的終止密碼子。通過(guò)設(shè)計(jì)、合成和組裝，福萊頓斯等人能夠在其編碼蛋白質(zhì)的序列中只使用64個(gè)密碼子中的61個(gè)，來(lái)構(gòu)造一個(gè)大腸桿菌基因組。他們用同義密碼子（“拼寫(xiě)”不同，但是能給出相同翻譯指令的密碼子）替換掉了兩個(gè)絲氨酸密碼子和一個(gè)終止密碼子。過(guò)去的工作中使用了基因組編輯工具已經(jīng)產(chǎn)生了一種合成大腸桿菌，它只使用64個(gè)密碼子中的63個(gè)，但這只需要將序列為T(mén)AG的終止密碼子（基因組中只含有321個(gè)這種終止密碼子）換成另一種終止密碼子。減少到61個(gè)密碼子則需要對(duì)多達(dá)18 214個(gè)密碼子進(jìn)行改變，這就必須用到基因組合成方法。

福萊頓斯和他的同事們利用大規(guī)模DNA組裝和基因組整合的方法構(gòu)建了他們的合成大腸桿菌基因組。他們先前已經(jīng)利用這些方法對(duì)大腸桿菌中密碼子更改極限進(jìn)行了探索。在他們的方法中，DNA被計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，化學(xué)合成并組裝成大小為100千堿基的片段，并在釀酒酵母中將其裝入載體；然后，這些載體被轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并直接整合入基因組對(duì)應(yīng)的自然區(qū)域中。將這一過(guò)程重復(fù)5次，結(jié)果就是DNA中的500千堿基片段被合成版本所取代。他們用這種方法生產(chǎn)了8株大腸桿菌，每一株都攜帶有合成的DNA片段，涵蓋基因組的不同區(qū)域。然后用接合法將這些片段接合起來(lái)，形成完整的合成基因組。

這次大規(guī)模構(gòu)建極其成功，脫靶突變率非常低，但也并非沒(méi)有挑戰(zhàn)性。大腸桿菌基因組中的許多基因與其他基因均有部分重疊，在91例重疊區(qū)域中均包含需要進(jìn)行改變的密碼子。這很復(fù)雜，因?yàn)橐粋€(gè)蛋白質(zhì)編碼序列的同義變化有可能會(huì)引起重疊序列編碼的氨基酸的改變。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究小組“重構(gòu)”了基因組中的79個(gè)位點(diǎn)，復(fù)制序列，將重疊的編碼序列分離成單獨(dú)的編碼序列（圖2）。

最終的菌株被證明可以存活，并能夠在一系列典型的實(shí)驗(yàn)室條件下生長(zhǎng)，盡管與野生型相比活力略弱。它不再使用終止密碼子TAG和兩個(gè)絲氨酸密碼子TCG和TCA，因此識(shí)別這些密碼子的細(xì)胞裝置現(xiàn)在就可以被刪除或重新分配，用以募集大多數(shù)活細(xì)胞通常使用的20種氨基酸以外的“非典型”氨基酸。這種招募在63密碼子型的大腸桿菌中已被證明是有用的，從生物技術(shù)項(xiàng)目角度來(lái)看，非典型氨基酸被編碼到所需的序列位置，以提供能夠參與自然蛋白質(zhì)所不能參與的化學(xué)反應(yīng)的殘基；從生物安全角度來(lái)看，可讀的DNA編碼信息在合成大腸桿菌內(nèi)和外的自然傳輸是有限的，因?yàn)榧?xì)胞的遺傳密碼的運(yùn)作方式與自然界其他生命體略有不同。預(yù)計(jì)所有這些用途都將在新的61密碼子型大腸桿菌中得到擴(kuò)展，該大腸桿菌有潛力編碼使用多個(gè)非典型氨基酸，并生成一個(gè)更為嚴(yán)格的基因防火墻（因?yàn)?4個(gè)密碼子中有3個(gè)不再被識(shí)別）。

合成一個(gè)擁有400萬(wàn)堿基對(duì)的基因組，并將遺傳密碼減少到61個(gè)密碼子，這是合成基因組學(xué)的新紀(jì)錄，但這個(gè)新紀(jì)錄可能不會(huì)維持太久。國(guó)際Sc2.0聯(lián)盟即將合成全部16個(gè)染色體共1 200萬(wàn)堿基對(duì)的釀酒酵母基因組——真核生物首個(gè)合成基因組，真核生物包括植物、動(dòng)物和真菌——57密碼子型大腸桿菌基因組的合成工作也正在進(jìn)行中。此外，科學(xué)家們還在構(gòu)建一種比野生型少兩個(gè)密碼子的鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因組。未來(lái)，這可能會(huì)使攜帶合成基因組的細(xì)菌能夠作為基于細(xì)胞的技術(shù)應(yīng)用于人類(lèi)腸道。

圖2 重編碼基因組的設(shè)計(jì)和構(gòu)建

從技術(shù)的角度來(lái)看，所有這些不同的項(xiàng)目的最有趣的方面是合成基因組的工作流結(jié)構(gòu)非常相似——千堿基的合成DNA片段在酵母細(xì)胞中（通過(guò)同源重組的過(guò)程）被組裝成50到100千堿基的碎片，之后（通過(guò)可選擇的重組方法）這些碎片被用來(lái)取代靶標(biāo)生物體內(nèi)的自然序列。方法標(biāo)準(zhǔn)化將使步驟自動(dòng)化，更多的研究小組將會(huì)進(jìn)入該領(lǐng)域?；蚪M最小化和密碼子簡(jiǎn)化只是這項(xiàng)新技術(shù)的第一個(gè)用途，終有一天這項(xiàng)新技術(shù)將會(huì)幫助我們構(gòu)建出功能重組的基因組和被設(shè)計(jì)用來(lái)指導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行特定任務(wù)的個(gè)性化定制基因組。