● 鐘佳賢 林澤苗 賈歡歡 吳玉娥 曾業(yè)文 李青南，▲

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性骨病，其特征在于骨量低和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加而易發(fā)骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了國家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。中醫(yī)學(xué)上并無骨質(zhì)疏松癥的病名，“骨痿”“骨枯”“骨痹”與此癥相近。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與腎臟密切相關(guān)，其次與脾胃、肝臟、血瘀等相關(guān)[2-4]，中醫(yī)的治療方法是滋補(bǔ)肝腎、健脾益氣、活血化瘀。中藥在骨質(zhì)疏松癥的治療中具有多靶點、多途徑、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)點，在緩解癥狀、增加骨量、防治骨質(zhì)疏松性骨折等方面效果顯著[5-6]。然而，近年來，有報道稱中藥引起的不良反應(yīng)以及藥源性疾病時有發(fā)生，其中不乏有肝腎功能損害的報道[7]，醫(yī)藥工作者對中藥的安全性給予了廣泛的關(guān)注。

護(hù)骨膠囊上市11年來，現(xiàn)代研究不斷進(jìn)行，關(guān)于去勢雌性大鼠致骨質(zhì)疏松模型的骨骼及骨重建狀態(tài)、血清骨代謝指標(biāo)、鈣相關(guān)激素和性激素的影響[8-11]等已發(fā)表相關(guān)論文，現(xiàn)進(jìn)一步觀察其對去勢雌性大鼠主要臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實驗藥物護(hù)骨膠囊(廣東安諾藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，專利號：ZL03117768.9，批號：20150101)。

1.2動物50只3個月大的SPF級雌性非妊娠SD大鼠，體重(210±3)g。由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證編號：44007200017783。將實驗動物飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所的籠子中，每籠3～4只(室溫23～27℃；相對濕度58%～60%)。

1.3試劑甲醛溶液、石蠟、二甲苯、無水乙醇、鹽酸乙醇、TO生物制片透明劑、蘇木精液、伊紅液、中性樹膠。

1.4儀器EG1150H+C Leica組織包埋機(jī)、TP1020 Leica自動脫水機(jī)、RM2255 Leica全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、HI1210 Leica攤片機(jī)、HI122 Leica烘片機(jī)、DM55 Leica生物顯微鏡，均購自德國徠卡儀器公司。

1.5實驗方法按隨機(jī)函數(shù)將大鼠分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、卵巢切除組(OVX組)和護(hù)骨膠囊低劑量組(HG-L組)、護(hù)骨膠囊中劑量組(HG-M組)、護(hù)骨膠囊高劑量組(HG-H組)，每組10只。假手術(shù)組將SD雌性大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，使用2%戊巴比妥鈉注射腹腔，去除卵巢周圍的部分脂肪，而其它組按照相同的方法操作，麻醉后去除雙側(cè)卵巢。手術(shù)后2天開始給藥，Sham組和OVX組灌服生理鹽水[10ml/(kg·d)]，HG-L、HG-M和HG-H組分別灌服等體積的護(hù)骨膠囊[分別為0.243g/(kg·10ml·d)、0.486g/(kg·10ml·d)、0.972g/(kg·10ml·d)]。其中，HG-M組是臨床成人的等效劑量。每天1次，共計3個月。每組大鼠用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水喂養(yǎng)，稱量體重并每周記錄1次，根據(jù)體重增加給藥劑量。各組大鼠給藥3個月后，用骨組織形態(tài)計量學(xué)的方法測量，與Sham組比較，OVX組大鼠的松質(zhì)骨骨量減少，骨結(jié)構(gòu)變差，動態(tài)參數(shù)分析表明骨形成率增加，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)增加，呈骨高轉(zhuǎn)換，提示實驗造模成功[8]。

在藥物干預(yù)結(jié)束時，用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用注射器抽取右心室的血液，分別取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺。主要臟器去除多余的脂肪和其它組織，并在相同條件下稱重。記錄數(shù)據(jù)后，按編號將組織置于10%的甲醛溶液固定24h，沖洗6h后，將一小部分心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺置于70%乙醇進(jìn)行組織脫水，然后用包埋機(jī)包埋在石蠟中。用切片機(jī)將主要臟器組織切出4μm薄片，用蘇木素-伊紅染液對切片染色，切片烘干后用顯微鏡觀察拍片。

2 結(jié)果與分析

2.1護(hù)骨膠囊對大鼠主要臟器重量的影響使用護(hù)骨膠囊3個月后，OVX組脾臟重量與Sham組相比顯著增加(P<0.01)，胸腺重量明顯下降(P<0.05)；與OVX組相比，HG-L組胸腺和HG-M組脾臟重量明顯增加(P<0.05)，其它組變化無統(tǒng)計學(xué)差異；與HG-L組相比，HG-H組的胸腺重量明顯下降；與HG-M組相比，HG-H組的脾臟重量明顯下降。見表1。

表1 應(yīng)用護(hù)骨膠囊對SD大鼠器官重量的影響

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01；與HG-L組比較，□P<0.05，□□P<0.01；與HG-M組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01

2.2護(hù)骨膠囊對大鼠心、肝、肺、腎、胸腺和脾臟組織形態(tài)的影響

2.2.1 心臟的組織形態(tài)變化 藥物組使用3個月對心臟組織形態(tài)的影響主要是細(xì)胞輕度水腫。Sham組的心肌細(xì)胞有橫紋，呈短圓柱形狀，有分支，并且核的形狀像橢圓形或矩形。與Sham組比較，OVX組心臟無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H組心肌細(xì)胞略有水腫，無其它病理改變。見圖1。

圖1 各組對大鼠心臟的影響(4um×10)

2.2.2 肝臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個月對肝臟無明顯影響。Sham組肝細(xì)胞呈臍帶狀，多角形，有肝小葉結(jié)構(gòu)，門靜脈區(qū)無擴(kuò)大，沒有炎癥反應(yīng)，肝板排列整齊。與Sham組比較，OVX組肝臟無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H的肝臟沒有顯著變化。見圖2。

圖2 各組對大鼠肝臟的影響(4um×10)

2.2.3 脾臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個月對脾臟無明顯的影響。Sham組有一定數(shù)量的淋巴結(jié)，脾竇內(nèi)含有少量的鐵血黃素。與Sham組比較，OVX組脾臟無明顯變化；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組脾臟無明顯變化。見圖3。

圖3 各組對大鼠脾臟的影響(4um×10)

2.2.4 肺的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個月對肺的影響主要是細(xì)胞水腫和靜脈瘀血。Sham組的肺泡細(xì)胞呈立方形或圓形，肺靜脈富含血液。與Sham組相比，OVX組肺泡細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫和肺靜脈充血；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組肺無明顯變化，見圖4。

圖4 各組對大鼠肺臟的影響(4um×10)

2.2.5 腎臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個月對腎臟無明顯影響。Sham組的腎小管細(xì)胞是單層立方上皮細(xì)胞，腎小球系膜胞體呈梭形或不規(guī)則星形和三角形。與Sham組相比，OVX組腎小管細(xì)胞無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H組腎小管細(xì)胞無明顯變化。見圖5。

圖5 各組對大鼠腎臟的影響(4um×10)

2.2.6 胸腺的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個月對胸腺無明顯影響。Sham組胸腺的胸腺囊較薄，皮質(zhì)較厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)明確，皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞密集，偶見凋亡細(xì)胞或凋亡小體。在髓質(zhì)中可以看到由上皮細(xì)胞組成的更多胸腺體。與Sham組比較，OVX組胸腺無明顯變化；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組胸腺無明顯變化。見圖6。

圖6 各組對大鼠胸腺的影響(4um×10)

3 討論

在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，中成藥對去勢大鼠影響的研究主要集中在骨骼方面，目前對其主要臟器的報道并不多見，但有糖皮質(zhì)激素對大鼠軟組織和免疫系統(tǒng)的研究[12]。本研究旨在探討護(hù)骨膠囊對SD大鼠主要臟器的影響，為藥物的安全性提供實驗依據(jù)。

結(jié)果顯示，卵巢切除組脾臟重量與假手術(shù)組相比顯著增加，而胸腺重量明顯下降；與卵巢切除組相比，護(hù)骨膠囊中劑量組脾臟和護(hù)骨膠囊低劑量組胸腺重量明顯增加。脾臟和胸腺都是機(jī)體最重要的免疫器官，在免疫功能調(diào)控中擔(dān)任重要角色。脾臟、胸腺重量是代表脾臟和胸腺大部分形態(tài)的重要指標(biāo)，而形態(tài)結(jié)構(gòu)可以大致反映器官的功能狀態(tài)。卵巢切除后脾臟重量增加，這和玫參顆粒對圍絕經(jīng)期大鼠內(nèi)分泌-免疫功能的影響中去卵巢后大鼠免疫器官脾臟系數(shù)降低的研究結(jié)果不符[13]，和張婷婷等[14]關(guān)于雌激素預(yù)防性給藥對去卵巢大鼠骨和臟器的影響中所得出的摘除大鼠卵巢會導(dǎo)致脾臟指數(shù)增加的研究結(jié)果相符，具體原因不明，有待深入研究。而胸腺重量明顯下降，這與衰老動物模型可導(dǎo)致大鼠脾臟和胸腺結(jié)構(gòu)與功能損傷，重量和指數(shù)都是降低的研究結(jié)果相符[15-16]。

相對OVX組，HG-M組治療后，脾臟重量明顯增加，HG-L組治療后，胸腺重量明顯增加，接近Sham組，HG-H組治療后，脾臟和胸腺無明顯變化。結(jié)果提示護(hù)骨膠囊中劑量和低劑量可能對脾臟和胸腺這兩大免疫器官有調(diào)節(jié)作用，推測原因是護(hù)骨膠囊組方中含有當(dāng)歸，而當(dāng)歸多糖在延緩大鼠的免疫系統(tǒng)衰老或損傷的機(jī)制中有一定的作用[14]，且護(hù)骨膠囊組方中的淫羊藿、制何首烏、熟地黃、龜甲、山藥和杜仲都有提高免疫功能的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。護(hù)骨膠囊低、中、高劑量治療后，基本改變?yōu)樾募〖?xì)胞輕度水腫，給藥組心肌細(xì)胞略有水腫、卵巢切除組的肺泡細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫和肺靜脈充血，其它臟器的組織形態(tài)學(xué)沒有發(fā)生明顯的病理改變。給藥組與卵巢切除組比較無明顯變化，表明護(hù)骨膠囊對骨質(zhì)疏松大鼠主要臟器沒有損傷。

綜上所述，本研究以去勢SD雌性大鼠主要臟器為考察對象，探究復(fù)方中藥護(hù)骨膠囊作用下主要臟器的影響。結(jié)果表明，護(hù)骨膠囊中劑量和低劑量治療后，脾臟和胸腺重量明顯增加，提示可能對脾臟和胸腺這兩大免疫器官有調(diào)節(jié)作用，推測是護(hù)骨膠囊組方中含有淫羊藿、制何首烏、熟地黃、龜甲、山藥和杜仲，這些藥材對免疫器官有影響。而HG-H組對這兩個臟器無明顯影響。去勢大鼠主要臟器的組織形態(tài)在灌服護(hù)骨膠囊低、中、高劑量3個月后未有明顯的病理變化，提示護(hù)骨膠囊的臨床用藥安全性。研究僅涉及到護(hù)骨膠囊對主要臟器重量和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，沒有涉及軟組織的指數(shù)，且尚未深入到對軟組織細(xì)胞學(xué)和相關(guān)蛋白組織的研究，還不夠全面，有待深入研究。本研究能為臨床應(yīng)用護(hù)骨膠囊提供安全性的證據(jù)，為骨質(zhì)疏松癥的防治開拓更安全有效的藥物提供更多選擇。