楊娟，李亞飛，宋曉燕，袁青玲，祁玉娟

（青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]，其在不同地域、種族和民族間存在差異[2]。腫瘤大小、淋巴結(jié)陽性率、激素受體、HER-2及Ki-67指數(shù)是乳腺癌預(yù)后因素[3]。Bcl-2作為一種凋亡抑制基因，對(duì)乳腺癌的預(yù)后及轉(zhuǎn)移具有預(yù)測作用[3-4]。本研究通過免疫組織化學(xué)法研究世居青海的藏族和漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Bcl-2、Bax、Caspase-3及凋亡指數(shù)（apoptosis index, AI）的表達(dá)，探究高海拔地區(qū)藏族與漢族乳腺癌生物學(xué)行為的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月—2015年12月在青海省人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的藏族和漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者各60例。臨床分期按美國癌癥聯(lián)合會(huì)第7版臨床分期[5]。以Bloom-Richardson系統(tǒng)方案對(duì)乳腺癌組織學(xué)進(jìn)行分級(jí)[6]。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

Bcl-2鼠抗人單克隆抗體（丹麥DAKO公司），Caspase-3、Bax 兔抗人單克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司），免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用丹麥DAKO公司ChemMate EnVision檢測系統(tǒng)K500711檢測試劑盒，原位DNA缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidy transferase-mediated digoxigenin-11-dUTP nick end labeling, TUNEL）選用瑞士羅氏公司診斷試 劑盒。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集及處理手術(shù)切除的新鮮乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本，取組織中心部分，10%中性甲醛溶液固定，分別用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色、免疫組織化學(xué)染色及AI研究。

1.3.2 HE染色將已固定的組織標(biāo)本經(jīng)梯度脫水、浸蠟及包埋后，以4μm厚度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)高壓處理組織切片后，修復(fù)暴露抗原。設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為已知陽性切片，空白對(duì)照用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗，嚴(yán)格遵守試劑盒說明書操作。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明，中性樹脂封片，顯微鏡 觀察。

1.3.4 TUNEL檢測AI嚴(yán)格遵守TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行制作石蠟切片，脫蠟、水化后細(xì)胞通透，加入TUNEL反應(yīng)液加入Converter-POD，與底物DAB反應(yīng)顯色，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照，分析結(jié)果；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置陽性及陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

染色陰性：無目標(biāo)細(xì)胞染色；染色陽性：弱陽性（+）（1%～25%）；陽性（++）（26%～50%）；強(qiáng)陽性（+++）（51%～75%）；強(qiáng)陽性（++++）（＞75%）。染色強(qiáng)度：弱染色：細(xì)胞染色在40物鏡視野才能看到；強(qiáng)染色：細(xì)胞染色在4倍或10倍物鏡視野能看到；中等染色：介于強(qiáng)染色與弱染色之間。細(xì)胞凋亡陽性判斷：光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞核，細(xì)胞核棕黃色為陽性細(xì)胞，呈均勻染色或顆粒狀。AI：陽性細(xì)胞在腫瘤中所占的百 分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的染色情況

Bcl-2染色陽性主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，Caspase-3和Bax染色陽性主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。見圖1。

2.2 TUNEL的染色情況

以光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡對(duì)原位凋亡細(xì)胞的觀察為金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上可表現(xiàn)為細(xì)胞核崩解、核膜消失、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成、細(xì)胞皺縮及碎裂等。見圖2。

2.3 藏族、漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床資料比較

高海拔地區(qū)藏族、漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、雌激素陰性與陽性受體、孕激素陰性與陽性受體、Ki-67不同比例及Her-2陰性與陽性等構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見 表1。

圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

圖2 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細(xì)胞形態(tài) （TUNEL染色）

表1 高海拔地區(qū)藏族、漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床資料比較 （n =60，例）

2.4 不同臨床病理特征乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)

120例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達(dá)率分別為45.0%（54/120）、69.2%（83/120）和59.2%（71/120）。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Bcl-2陽性患者淋巴結(jié)是否結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體陰性與陽性及孕激素受體陰性與陽性等構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Caspase-3陽性患者雌激素受體陰性與陽性構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。120例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者其他臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見 表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)比較 例（%）

2.5 高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者不同臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)

高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Bcl-2陽性患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及雌激素受體陰性與陽性等構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Caspase-3陽性患者雌激素受體陰性與陽性構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者其他臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

2.6 高海拔地區(qū)藏族、漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達(dá)

高海拔地區(qū)藏族、漢族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

表3 藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者不同臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)情況比較 例（%）

表4 高海拔地區(qū)不同民族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達(dá)比較 [n =60，例（%）]

2.7 高海拔地區(qū)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Bcl-2、Bax及Caspase-3的比較

高海拔地區(qū)浸潤性乳腺癌Bcl-2陽性與陰性患者的Caspase-3表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Bcl-2陽性與陰性患者的Bax、Caspase-3表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表5、6。

2.8 高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者AI與臨床病理特征的關(guān)系

高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者AI陽性與陰性構(gòu)成比分別為37/23和36/24，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.035，P =0.852）。

高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者AI陽性與陰性患者腫瘤大小、臨床分期及孕激素受體陰性與陽性等構(gòu)成比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；但年齡、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、雌激素受體陰性與陽性、Ki-67不同比例及Her-2陰性與陽性等構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表7。

表5 高海拔地區(qū)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Bcl-2表達(dá)與Bax、Caspase-3表達(dá)的關(guān)系 例

表6 高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Bcl-2表達(dá)與Bax、Caspase-3表達(dá)的關(guān)系 例

表7 高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者AI與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)癌基因和抑癌基因的失活及細(xì)胞增殖與凋亡的失衡有關(guān)。高海拔地區(qū)獨(dú)特的高寒、缺氧環(huán)境，是該地區(qū)藏族乳腺癌的高發(fā)病率及高病死率的重要原因。不同民族間凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)差異的研究相對(duì)較少。

Bcl-2在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面起重要作用[7]，其表達(dá)程度與p53的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且與乳腺癌預(yù)后呈正相關(guān)[8]。體外實(shí)驗(yàn)的不同細(xì)胞模型中Bcl-2的高表達(dá)導(dǎo)致生長抑制，這與Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，還與延長細(xì)胞周期有關(guān)[9]。有研究表明，腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者中，Bcl-2的高表達(dá)水平對(duì)總生存的延長有獨(dú)立的預(yù)測作用[10]。楊黎等[11]研究認(rèn)為，Bcl-2可用于判斷乳腺癌生存預(yù)后，并與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素?zé)o關(guān)。本研究提示，Bcl-2表達(dá)與雌激素受體、孕激素受體表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、Ki-67及Her-2表達(dá)無關(guān)。也有研究表明，Bcl-2表達(dá)受雌激素調(diào)節(jié)。Bcl-2在雌激素受體、孕激素受體陽性乳腺癌中高表達(dá)[12-13]，這與本研究的結(jié)果一致，提示Bcl-2高表達(dá)乳腺癌患者采用內(nèi)分泌治療效果會(huì)更好。

Bax是誘導(dǎo)凋亡基因，其和Bcl-2共同平衡細(xì)胞的生存與凋亡。既往研究表明，Bax表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)，＞5 cm的乳腺腫瘤中Bax表達(dá)更高[14]。SHARIFI等[15]研究認(rèn)為，Bcl-2/Bax比例影響紫杉醇在乳腺癌化療中的療效。楊黎等[11]研究表明，Bax表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期晚有關(guān)，并認(rèn)為Bax與不良的生物學(xué)特性相關(guān)。本研究結(jié)果提示，Bax表達(dá)與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體、孕激素受體、Ki-67及Her-2表達(dá)無關(guān)，這可能是由于本研究相關(guān)較小的樣本量導(dǎo)致，在今后的研究中會(huì)考慮擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步觀察結(jié)果。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器。黑靜雅等[16]研究認(rèn)為，Caspase-3是凋亡的核心蛋白酶，其表達(dá)下調(diào)和缺失與惡性腫瘤逃避細(xì)胞凋亡的自我調(diào)節(jié)相關(guān)。本研究結(jié)果提示，高海拔地區(qū)乳腺癌Caspase-3的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及雌激素受體表達(dá)相關(guān)。Caspase-3是乳腺癌臨床評(píng)價(jià)腫瘤生物學(xué)及判斷預(yù)后的參考指標(biāo)。腫瘤組織AI對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有重要作用[17]。本研究結(jié)果認(rèn)為，高海拔地區(qū)藏族乳腺浸潤性導(dǎo)管癌AI與腫瘤大小、臨床分期、孕激素受體表達(dá)相關(guān)，且AI的表達(dá)與民族無關(guān)。

綜上所述，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的治療及預(yù)后具有一定的提示作用。中國漢族乳腺癌的研究較多，而少數(shù)民族乳腺癌的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究的結(jié)果對(duì)高海拔地區(qū)的乳腺浸潤性導(dǎo)管患者個(gè)體化治療方案的制定，以及預(yù)后判斷具有提示作用。