張建春，吳接呈，張筑宏，王蘭英，駱焱平

(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228)

刺芫荽(EryngiumfoetidumL.)別名野香菜、刺芹、洋芫荽等，為傘形科刺芹屬多年生草本植物[1]，在我國主要分布于海南、廣東、廣西、云南等熱帶、亞熱帶地區(qū)[2]，是一種藥蔬兩用植物，具有顯著的消炎、抑菌的功效，極具開發(fā)價(jià)值[3]。目前關(guān)于刺芫荽提取物的研究取得了一定進(jìn)展，如文獻(xiàn)[4]發(fā)現(xiàn)刺芫荽水煎劑具有局部抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用；文獻(xiàn)[5]發(fā)現(xiàn)刺芫荽的己烷提取物也具有的抗炎活性，并且確定了其主要成分為谷甾醇；文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)刺芫荽新鮮及干燥葉水提物還能抑制蛇、蝎毒液對紅細(xì)胞的溶血作用。文獻(xiàn)[7]發(fā)現(xiàn)刺芫荽水提物對多種細(xì)菌有一定的抑制作用，其中，對白喉?xiàng)U菌的作用較消炎散結(jié)片強(qiáng)。文獻(xiàn)[8]發(fā)現(xiàn)刺芫荽葉提取物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有較好的抑制作用[8]。文獻(xiàn)[9]發(fā)現(xiàn)刺芫荽對胸膜炎模型大鼠炎性細(xì)胞因子的影響，說明其治療感染性疾病的作用不單純在于抗菌，而可能對復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行協(xié)調(diào)?？梢姶誊据刺崛∥锞邆涠喾N功效，備受科研者的廣泛關(guān)注。本研究擬通過對刺芫荽葉乙醇提取物的總多酚、總黃酮的含量，對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用以及對高價(jià)鐵離子還原能力的測定來評價(jià)刺芫荽的抗氧化活性，以期為刺芫荽開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑刺芫荽提取物(刺芫荽采自海南省五指山地區(qū))；蘆丁、沒食子酸和叔丁基對苯二酚(TBHQ)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 提取物的制備將采集的刺芫荽葉洗凈，室內(nèi)自然陰干，碾碎，稱質(zhì)量后加入95%無水乙醇中，避光浸提3 d。抽濾，得到濾液。濾渣在相同條件下再浸提1次，合并濾液，減壓濃縮，得到浸膏，置于室溫陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 提取物總多酚含量的測定參照文獻(xiàn)[10]的方法測定，略有改動(dòng)。用95%無水乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物樣品，移取1 mL樣品液于試管中，加入0.5 mL 福林-薛卡多(Folin-Ciocalteu)試劑和5 mL蒸餾水，充分混勻，在室溫下反應(yīng)5 min。再向試管中加入1 mL 5%碳酸鈉溶液，混勻，室溫下黑暗處理60 min。在760 nm處測定樣品的吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以沒食子酸(60，40，20，10，5，2.5 μg·mL-1)為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物的總多酚含量。

1.4 提取物總黃酮含量的測定參照文獻(xiàn)[11]的方法，略有改動(dòng)進(jìn)行測定。用95%的乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物樣品，移取0.5mL樣品液于試管中，加入0.1 mL 10%氯化鋁溶液、0.1 mL醋酸鉀溶液、4.3 mL蒸餾水，充分混勻，室溫下孵育30 min。在415 nm下測定樣品液的吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以蘆丁(0.32，0.16，0.08，0.04，0.02，0.01 g·L-1)為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物的總黃酮含量。

1.5 提取物對DPPH自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行，略有改動(dòng)進(jìn)行測定。將樣品溶液稀釋為1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 g·L-1。取3.5 mL 2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)溶液于試管中，向試管中加入0.5 mL不同濃度的樣品溶液，充分搖勻，在室溫下孵育30 min，在517 nm下測定的吸光度為A。用0.5 mL 95%無水乙醇代替樣品溶液與3.5 mL DPPH溶液加入試管，測其吸光度為A1；用0.5 mL雙蒸水代替樣品液與3.5 mL的無水乙醇混合，同時(shí)以其作為空白對照，測95%無水乙醇和雙蒸水的吸光度為A0。將蘆丁稀釋成與樣品相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照，代替樣品進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次試驗(yàn)。并計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率以及半數(shù)清除作用濃度IC50值。按以下公式計(jì)算：

式中：A為樣品溶液和DPPH溶液的平均吸光度；A0為95%無水乙醇和雙蒸水的平均吸光度；A1為95%無水乙醇和DPPH溶液的平均吸光度。

1.6 提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定參照芬頓(Fenton)反應(yīng)[13]的方法，略有改動(dòng)。將樣品溶液稀釋為0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05 g·L-1。取300 μL樣品溶液于試管中，依次加入1 mL 1.5 mmol·L-1硫酸鐵溶液、0.7 mL 6 mmol·L-1過氧化氫溶液和1.2 mL 6 mmol·L-1水楊酸鈉溶液，充分搖勻。37℃反應(yīng)5 min，在510 nm下測定樣品的吸光度為A1；用雙蒸水代替樣品液作空白對照，按同樣步驟測吸光度為A0。每個(gè)處理重復(fù)3次，分別求吸光度平均值。以特丁基對苯二酚(TBHQ)作陽性對照，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。按以下公式計(jì)算：

式中：A0為空白對照平均吸光度；A1為加樣品的平均吸光度；

1.7 提取物對高價(jià)鐵離子還原能力的測定參照文獻(xiàn)[14]的方法，略有改動(dòng)。取100 μL樣品溶液于試管中，加入3 mL FRAP溶液[25 mL 300 mmol·L-1醋酸鹽緩沖溶液、2.5 mL 0.01 mol·L-1三吡啶三嗪(TPTA)溶液、2.5 mL 0.02 mol·L-1六水合三氯化鐵溶液]，充分搖勻。37 ℃反應(yīng)30 min，在59 3nm測定樣品的吸光度。七水合硫酸亞鐵代替樣品液，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度：0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 5 g·L-1，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，求吸光度平均值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD) , 采用spss22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的總多酚含量測定以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液的吸光度為縱坐標(biāo)，擬合回歸方程為y=0.005 6x+0.125 1，相關(guān)系數(shù)R2為0.981。表明沒食子酸在質(zhì)量濃度為0～80 mg·L-1范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于刺芫荽葉乙醇提取物總多酚的定量測定。測得刺芫荽葉乙醇提取物為1 g·L-1時(shí)總多酚相對超純水吸光度平均值為0.255，由上述方程計(jì)算該樣品的總多酚含量為1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(dāng)(23.2±0.01)μg的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 。

2.2 提取物的總黃酮含量測定以蘆丁為參比標(biāo)準(zhǔn)來衡量提取物中黃酮類化合物的含量，以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，505 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為y=0.797x+0.162 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.974 1，說明方程相關(guān)性好。測定0.5 g·L-1提取物的吸光值為0.541，由上述方程計(jì)算該提取物的總黃酮含量為1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(dāng)于(0.96±0.02)μg的蘆丁純品。

2.3 提取物對DPPH自由基的清除能力測定測定刺芫荽葉乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力見圖1，由圖1可見，該提取物在0.1～1 g·L-1濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，且清除率隨濃度的增大而升高。計(jì)算其回歸方程為y=1.288 6x+5.410 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.916，對DPPH自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.48 g·L-1。同時(shí)測得蘆丁回歸方程為y=1.244 9x+5.741，相關(guān)系數(shù)R2為0.887，計(jì)算蘆丁的半抑制濃度(IC50)為0.25 g·L-1。刺芫荽葉乙醇提取物對DPPH自由基清除作用稍弱于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 提取物及蘆丁溶液DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging rate of extract and rutin圖2 提取物及TBHQ溶液羥基自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of extract and TBHQ

2.4 提取物對羥自由基(·OH)清除能力的測定以2-叔丁基對苯二酚(TBHQ)為陽性對照，測定刺芫荽葉乙醇提取物對羥自由基的清除作用(圖2)。由圖2可見，在0.05～0.8 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加該提取物對羥自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)。計(jì)算回歸方程為y=0.749 7x+5.276 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.936，對羥自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.43 g·L-1。同時(shí)計(jì)算TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程為y=0.998 1x+5.553 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.917，對羥自由基清除作用半抑制濃度(IC50)為0.28 g·L-1。相比之下，刺芫荽葉乙醇提取物對羥自由基的清除活性低于TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品。

2.5 提取物對高價(jià)鐵離子的還原能力測定以FeSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，593 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，擬合回歸方程為y=1.778 8x+0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2為0.973。測得刺芫荽葉乙醇提取物為1 mg·mL-1時(shí)還原鐵的相對超純水吸光度平均值為0.358，由上述方程計(jì)算該樣品還原鐵的含量為1 mg提取物干粉的還原力相當(dāng)于0.72 mmol·L-1的七水合硫酸亞鐵。由此可見該提取物具有很好的高價(jià)鐵離子的還原能力。

3 討 論

本研究采用乙醇對刺芫荽葉進(jìn)行浸提，測定了該提取物的總多酚含量、總黃酮含量以及對DPPH自由基、羥自由基的清除作用和高價(jià)鐵離子的還原能力。結(jié)果表明：1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(dāng)(23.2±0.01)μg的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品；1 mg提取物干粉的抗氧化能力相當(dāng)于(0.96±0.02)μg的蘆丁純品；1 mg提取物干粉的還原力相當(dāng)于0.72 mmol ·L-1的七水合硫酸亞鐵；提取物對DPPH自由基和羥自由基的清除率低于對照的藥劑?？傮w來看，提取物抗氧化活性較好。這一結(jié)論驗(yàn)證了劉志東[15]等人提出刺芫荽是天然抗氧化劑的重要來源這一觀點(diǎn)。

自由基的清除是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)理[16]。大量研究結(jié)果證明，刺芫荽全株含豆甾醇類物質(zhì), 嫩葉富含十二碳烯醛、十四烯醛、十二醛、月桂酸等多種芳香物質(zhì)，如高燕等研究發(fā)現(xiàn)2-十二碳烯醛是刺芫荽特征香氣的主要成分，具有柑橘和脂肪氣味[17]。JAN BANOUT等的研究也證明了刺芫荽水提取物中2-十二碳烯醛是主要成分，其次是正十二烷醛，2-十四烯醛和1-十四烯[18]。本研究尚未對提取物成分進(jìn)行分析，在后續(xù)研究中尋找清除自由基的物質(zhì)是追蹤刺芫荽抗氧化作用機(jī)理的關(guān)鍵。