楊若穎，李 嬋，葉明亮，張丹陽(yáng)，馮俊濤,2，閆 合,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

植物源農(nóng)藥的主要成分來(lái)源于自然，具有選擇性高、低毒、易降解，害物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[1], 從植物中尋找抑菌活性物質(zhì), 是研發(fā)新型殺菌劑的熱點(diǎn)之一?，庒t(yī)藥是瑤族人民長(zhǎng)期與疾病作斗爭(zhēng)的智慧結(jié)晶，104 味經(jīng)典老班藥中，很多是治療細(xì)菌感染的藥物，這為新型抑菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供了線(xiàn)索。事實(shí)上，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)具農(nóng)藥活性植物的篩選一直沒(méi)有停止，但針對(duì)瑤藥的農(nóng)用活性篩選卻少見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)我國(guó)部分瑤藥植物的甲醇提取物進(jìn)行抑菌活性的篩選，旨在篩選出具有較高活性抑菌植物，為開(kāi)發(fā)新型植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料煙草青枯菌(Ralstoniasolanacearum)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)標(biāo)準(zhǔn)菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923購(gòu)買(mǎi)自廣東省微生物菌種保藏中心。供試瑤藥購(gòu)買(mǎi)自廣西省南寧市大福子原生草藥店，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院李琰副教授鑒定。31種瑤藥及其科屬見(jiàn)表1。分析純甲醇和分析純DMSO購(gòu)自四川西隴化工有限公司；電子天平， ALC-1100.2，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀，R205B型，上海申生科技有限公司；超聲波清洗器，KQ-250B，昆山市超聲儀器生產(chǎn)公司；循環(huán)水式多用真空泵，SHB-B95A型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司。

1.2 瑤藥樣品的提取采用超聲波提取法將陰干的植物材料在40 ℃下烘干，粉碎后過(guò)40目篩，放入自封袋中。試驗(yàn)前稱(chēng)取50 g的植物干粉，加入甲醇進(jìn)行超聲波提取，每次60 min，重復(fù)提取3次。過(guò)濾后濃縮，保存于4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.3 培養(yǎng)基配制方法室內(nèi)生測(cè)用于活化細(xì)菌性病原菌菌株的液體培養(yǎng)液(LB培養(yǎng)基): 稱(chēng)取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉3 g, 加水定容至1 L, 滅菌鍋滅菌待用。

1.4 藥劑配制采用對(duì)供試病菌沒(méi)有抑菌作用的二甲基亞砜作為溶劑, 將供試瑤藥提取物溶解。用二甲基亞砜-水溶液將各瑤藥提取物按其有效成分含量溶解稀釋成1 000 mg·L-1藥液 (作為母液備用)。

1.5 供試菌種的準(zhǔn)備將供試菌種在試驗(yàn)前1 d轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中, 置于28℃恒溫?fù)u床箱中活化12 h。

1.6 室內(nèi)抑菌活性篩選和最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定方法采用二倍稀釋法對(duì)瑤藥提取物進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性篩選和最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定[2]。測(cè)定方法: (1) 室內(nèi)抑菌活性篩選方法：實(shí)驗(yàn)操作在96孔板上進(jìn)行, 每孔加入50 μL稀釋后細(xì)菌數(shù)量達(dá)104cfu·mL-1的供試菌菌懸液與50 μL質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1藥液，使藥液最終濃度為500 mg·L-1，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果；再進(jìn)一步將母液稀釋為200 mg·L-1藥液，實(shí)驗(yàn)操作方法同上，使藥液最終濃度為100 mg·L-1，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果；(2) 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定方法：取編號(hào)為1～5的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里滅菌待用。滅菌完成后，除1號(hào)試管加入4 mL無(wú)菌水外，其余試管均加入2 mL無(wú)菌水。將1 mL配制好的質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的母液加入1號(hào)試管中，混合均勻后，將混合后的藥液取2 mL加入到2號(hào)試管中，以此操作至5號(hào)試管為止。使藥液濃度稀釋為200，100，50 ，25，12.5 mg·L-1共5個(gè)濃度。在96孔板上每孔加入50 μL稀釋后細(xì)菌數(shù)量達(dá)104cfu·mL-1的供試菌菌懸液與50 μL藥液，使藥液最終濃度為100，50，25，12.5，6.25 mg·L-1，以硫酸鏈霉素作為對(duì)照藥劑。培養(yǎng)24 h后，通過(guò)肉眼比對(duì)發(fā)現(xiàn)微孔內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無(wú)沉淀產(chǎn)生, 則此微孔對(duì)應(yīng)的藥液濃度即為此提取物對(duì)待測(cè)病菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 31種瑤藥提取物對(duì)煙草青枯菌的室內(nèi)抑菌活性篩選采用二倍稀釋法在500，100 mg·L-1的濃度下，測(cè)定了31種瑤藥植物的甲醇提取物對(duì)煙草青枯菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在500 mg·L-1的濃度下有18種瑤藥提取物表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，在100 mg·L-1的質(zhì)量濃度下有3種瑤藥提取物表現(xiàn)出顯著的抑菌活性(表1)。

表1 供試瑤藥對(duì)煙草青枯的初篩活性Tab.1 Primary screening of antibacterial activity of Yao medicinal plants against Ralstonia solanacearum

續(xù)表1 Continued Tab.1

注：1.對(duì)煙草青枯菌的活性測(cè)定采用二倍稀釋法；2.“抑菌活性”列，標(biāo)注“+”和“-”分別表示該樣品“具顯著抑菌活性”和“無(wú)顯著抑菌活性”
Note：The activity ofRalstoniasolanacearumwas assayed by double dilution method; the ‘ +’ and ‘-’ in the column of inhibitory activity indicate 'significant inhibitory activity and no significant inhibitory activity, respectively.

2.2 抑菌活性顯著的瑤藥提取物的MIC測(cè)定結(jié)果采用二倍稀釋法對(duì)穿破石、獨(dú)腳風(fēng)、貫眾等3種瑤藥提取物進(jìn)行最低抑菌濃度測(cè)定(表2)。結(jié)果表明：3種瑤藥提取物對(duì)煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制效果。3種瑤藥提取物對(duì)煙草青枯菌的MIC分別為25，25，25 μg·mL-1，對(duì)蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為12.5，50，50 mg·L-1，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別為50，25，50 mg·L-1。

表2 3種瑤藥提取物對(duì)煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果Tab. 2 Assay of MIC of extracts of three species of Yao medicinal plants against R.solanacearum, B.cereus, S.aureus

續(xù)表2 Continued Tab.2

注：1.“-”表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液澄清透明無(wú)沉淀；2.“+”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液渾濁有沉淀
Note：“-” indicates no bacterial growth, and the culture solution was clear, translucent and contained n precipitation; “+” indicates bacterial growth and the culture solution was not clear and contained precipitations.

3 討 論

我國(guó)對(duì)具農(nóng)藥活性植物的篩選，一般是參考《本草綱目》等古籍和《中國(guó)土農(nóng)藥志》《中國(guó)有毒植物》等專(zhuān)著及在生產(chǎn)中人們使用的土農(nóng)藥[3]。前期，國(guó)內(nèi)多位學(xué)者對(duì)我國(guó)陜、甘、青、新、寧、蘇、粵、桂、鄂、閩、川、黔等地區(qū)的2 000 多種野生植物或中草藥進(jìn)行了農(nóng)用活性的篩選，發(fā)現(xiàn)了砂地柏、牛心樸子、掌葉千里光、辛夷、廣陳皮、博落回等多種植物具有較好的殺蟲(chóng)活性；茄科、百部科、藜科、馬錢(qián)科、豆科、菊科、仙茅科、玄參科、蕓香科、天南星科、姜科、唇形科、菊科、桔?？?、忍冬科、傘形科、蓼科、大戟科等植物的殺蟲(chóng)活性值得深入研究；豆科、禾本科、菊科、傘形科、十字花科、馬兜鈴科、唇形科、葫蘆科、蓼科、木蘭科、百合科、木犀科、莎草科和樟科等植物的殺菌活性具開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。近 10 余年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者篩選的范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)更加注重對(duì)植物源物質(zhì)特殊生物活性的發(fā)現(xiàn)[4]。

瑤族是我國(guó)少數(shù)民族之一，在廣西生活的瑤族占全國(guó)瑤族總?cè)丝?0%以上，大多聚居在金秀、巴馬、都安、大化、富川和恭城等6個(gè)瑤族自治縣內(nèi)?，幾迦嗣裨陂L(zhǎng)期的生活實(shí)踐中總結(jié)出一套有效的防病、治病經(jīng)驗(yàn)，其方法簡(jiǎn)單實(shí)用，療效確切?，庒t(yī)藥是瑤族人民長(zhǎng)期與疾病作斗爭(zhēng)的智慧結(jié)晶，具有鮮明的民族特色，瑤族醫(yī)藥歷來(lái)靠口傳心授、代代相傳而得以傳承。在各級(jí)政府和諸多瑤醫(yī)藥專(zhuān)家的共同努力下《瑤醫(yī)效方選編》《中國(guó)瑤醫(yī)學(xué)》《實(shí)用瑤醫(yī)學(xué)》《中國(guó)現(xiàn)代瑤藥》等著作先后出版，標(biāo)志瑤醫(yī)藥的理論體系初步形成[5]。由于瑤族生活區(qū)域濕熱的氣候特點(diǎn)，使瑤藥具有不同于北方中醫(yī)藥系統(tǒng)的特色。104 味經(jīng)典老班藥中，大多數(shù)為治療細(xì)菌感染的藥物，而這可以給殺菌劑的發(fā)現(xiàn)提供重要的線(xiàn)索。因此，本研究針對(duì)瑤藥開(kāi)展抑菌農(nóng)用活性篩選，采用二倍稀釋法篩選了31種瑤藥提取物的抑菌活性, 并測(cè)定了初篩高活性瑤藥提取物對(duì)煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。結(jié)果表明，穿破石、獨(dú)腳風(fēng)、貫眾3種瑤藥提取物均具有顯著抑制煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等3種植物病原細(xì)菌的活性。

有研究表明，穿破石根提取物對(duì)梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌以及玉米炭疽病菌有很高的抑菌活性[6], 綿馬貫眾醇提液和水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、白喉?xiàng)U菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用[7]。由此可見(jiàn)，穿破石、貫眾有多種抑菌活性，然而獨(dú)腳風(fēng)的抑菌活性卻少見(jiàn)報(bào)道。因此，穿破石、獨(dú)腳風(fēng)、貫眾這3種瑤藥有開(kāi)發(fā)為新型植物源殺細(xì)菌劑的潛力，值得進(jìn)一步深入研究。