孫思睿，萬(wàn) 峰，趙鵬昊，侯雨佳，范小飄，梁 玉，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸桿菌的一種，常用作益生菌，廣泛存在于谷物、乳肉制品、果蔬制品及發(fā)酵飲料中，也常用于生產(chǎn)某些發(fā)酵產(chǎn)品，是一種重要的工業(yè)微生物。在食品生產(chǎn)中乳酸菌會(huì)面臨多種環(huán)境脅迫，如加工過(guò)程中的高壓脅迫[1]、發(fā)酵過(guò)程中的酸脅迫[2]以及貯藏過(guò)程中的冷脅迫[3]等，其中鹽脅迫也逐漸引起人們的關(guān)注。食鹽是泡菜、醬制品、發(fā)酵肉制品及干酪等發(fā)酵制品中必不可少的添加物，主要作用是調(diào)味和延長(zhǎng)貯存期；然而一定濃度鹽會(huì)增加環(huán)境滲透壓，易使乳酸菌細(xì)胞失水，細(xì)胞質(zhì)濃縮，會(huì)在一定程度上影響其正常生理功能。因此，乳酸菌對(duì)鹽的耐受性在一定程度上會(huì)影響其發(fā)酵特性，對(duì)生產(chǎn)意義重大。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是乳酸菌與外界環(huán)境進(jìn)行信息交流的重要調(diào)控系統(tǒng)，通常由信號(hào)分子和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（包括組氨酸蛋白激酶和相應(yīng)調(diào)節(jié)因子）兩部分組成。AI-2是一類重要的信號(hào)分子，可以進(jìn)行細(xì)菌間的溝通，其中LuxS蛋白酶是AI-2合成的關(guān)鍵酶，因此其編碼基因luxS在QS系統(tǒng)中具有重要作用[4]。當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值后，便會(huì)激活特定基因的表達(dá)，以調(diào)控某個(gè)單個(gè)細(xì)菌無(wú)法完成的生理功能[5]，如生物發(fā)光[6]、生物膜形成[7]、細(xì)菌素的合成[8]、耐受性[9]及黏附性[10]等。luxS介導(dǎo)的QS過(guò)程已被證明可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)[11]，且該基因序列高度保守，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)luxS基因與耐酸能力有很大關(guān)系，但對(duì)細(xì)菌素合成及鹽耐受性的影響知之甚少。

L. plantarum KLDS1.0391是從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的1 株生理特性良好的產(chǎn)細(xì)菌素菌株，由全基因組信息得知[12]，該菌具有多種與脅迫相關(guān)的蛋白，包含5 個(gè)膽鹽脅迫相關(guān)基因、13 個(gè)溫度脅迫相關(guān)基因以及4 個(gè)滲透壓脅迫相關(guān)基因等。前期研究結(jié)果證實(shí)該菌含有l(wèi)uxS基因[13]；并已發(fā)現(xiàn)：QS可調(diào)節(jié)該菌與其他細(xì)菌共培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌素的合成[13]，但還不清楚該菌鹽脅迫耐受性是否受QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)。

本研究通過(guò)測(cè)定野生株和luxS基因缺失突變株在不同濃度鹽脅迫下的生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成情況，探究luxS基因在L. plantarum KLDS1.0391應(yīng)對(duì)NaCl脅迫時(shí)的作用，從而揭示在NaCl脅迫時(shí)L. plantarum中QS系統(tǒng)對(duì)該菌株生長(zhǎng)及代謝的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

L. plantarum KLDS1.0391野生株及l(fā)uxS基因缺失突變株均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC6633 中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)[14-15]。

氯霉素（chloramphenicol，CAP）、溶菌酶 美國(guó)Amresco公司；PrimerScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、DL5000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌總RNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶 天根生化科技有限公司；瓊脂糖、過(guò)氧化氫酶 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；0.22 μm微孔濾膜 美國(guó)Bio-Rad公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；ZHWY200B型全溫度恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-8D型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；9700 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystem公司；Step One PlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；Delta320 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多有限公司；UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 luxS基因缺失突變株的構(gòu)建與擴(kuò)培

參照文獻(xiàn)[16]，并對(duì)構(gòu)建成功的突變株進(jìn)行氯霉素抗性平板及PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸210 s，33 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。分別將L. plantarum KLDS1.0391野生株及l(fā)uxS基因缺失突變株于MRS及含氯霉素的MRS培養(yǎng)基中37 ℃活化3 代，進(jìn)行之后實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 鹽耐受能力比較

將活化后的野生株和突變株過(guò)夜培養(yǎng)，分別取10 mL菌液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌2 次后等體積重懸于含0%、2%、3%、4%、6%以及8% NaCl的磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃孵育24 h，分別測(cè)定在孵育0、8、16 h和24 h時(shí)2 株菌的活菌數(shù)，并按下式計(jì)算存活率：

1.3.3 生長(zhǎng)性能比較

分別將野生株和突變株以2%的接種量接種于含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，每隔4 h取樣，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 產(chǎn)細(xì)菌素能力比較

在1.3.3節(jié)取樣間隔，每個(gè)樣品取10 mL菌液，12 000 r/min離心15 min收集無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，按參考文獻(xiàn)[17]采用雙層平板打孔法測(cè)定抑菌活性，以B. subtilis作為上層指示菌，打孔后上樣量為100 μL。

1.3.5 部分基因表達(dá)的比較

1.3.5.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

以16S rDNA作為內(nèi)參基因，目的基因?yàn)榧?xì)菌素結(jié)構(gòu)基因plnEF以及QS調(diào)節(jié)基因plnD和plNC8HK。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1[18]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.3.5.2 總RNA提取

分別將野生株與突變株在含0%、2%及4% NaCl的MRS中培養(yǎng)24 h后，取菌液（要求所收集菌體數(shù)量小于1×109CFU/mL）于4 ℃、12 000 r/min離心2 min，棄上清液收集菌體。RNA提取過(guò)程參照天根細(xì)菌總RNA提取試劑盒（DP430）說(shuō)明書(shū)，分別提取上述菌體的總RNA。

1.3.5.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

首先在反轉(zhuǎn)錄前去除基因組DNA，然后在冰浴上按PrimerScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)混合體系并合成cDNA，合成后于4 ℃保存。

1.3.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

依據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)液的配制。反應(yīng)體系總體積為20 μL。PCR參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，共40 個(gè)循環(huán)數(shù)[16]。在任一鹽濃度脅迫下，均以野生株樣品為校準(zhǔn)樣品，以同濃度下luxS基因突變株樣品為待測(cè)樣品，通過(guò)2-ΔΔCt分析不同待測(cè)樣品基因的表達(dá)差異[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果均為3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，用 ±s表示。采用Excel及Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，并利用SPSS 17.0程序進(jìn)行方差分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 luxS基因缺失突變株的驗(yàn)證

前期研究已經(jīng)成功構(gòu)建luxS基因缺失突變株[16]，由于質(zhì)粒自身性質(zhì)不穩(wěn)定且基因敲除后具有一定復(fù)原性，在長(zhǎng)時(shí)間貯存后性狀易發(fā)生改變，因此在實(shí)驗(yàn)前對(duì)突變株進(jìn)行驗(yàn)證。在含4 mg/L CAP的抗性平板上劃線結(jié)果顯示，野生株在抗性平板上不生長(zhǎng)，而luxS基因缺失突變株正常生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 luxS基因缺失突變株抗性平板驗(yàn)證Fig. 1 Verification of luxS gene deletion mutant strain by resistant plate

分別挑取抗性MRS平板上生長(zhǎng)的突變株單菌落及普通MRS平板上生長(zhǎng)的野生株單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，野生株在2.9 kb處有一條明亮條帶為luxS基因片段（圖2泳道1），而突變株分別在2.9 kb和3.4 kb處有兩條明亮的特異性條帶（圖2泳道2）。由于L. plantarum KLDS1.0391具有2 個(gè)luxS基因片段，突變株的2 條特異性條帶分別為同源重組的轉(zhuǎn)化子與luxS基因片段，表明打靶片段仍同源重組在基因組中，因此該突變株為L(zhǎng). plantarum KLDS1.0391 luxS單基因缺失突變株。

圖2 luxS基因缺失突變株菌落PCR驗(yàn)證Fig. 2 Verification of luxS gene deletion mutant strain by PCR

2.2 luxS基因?qū)闚aCl耐受能力的影響

在6 種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl脅迫條件下，L. plantarum KLDS1.0391野生株與luxS基因缺失突變株在脅迫24 h內(nèi)存活率的變化如圖3所示。在孵育過(guò)程中，無(wú)論luxS基因缺失與否，L. plantarum KLDS1.0391存活率均隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低，且野生株對(duì)NaCl具有較好的耐受能力，在8% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下脅迫24 h后存活率仍能達(dá)到80%以上。

圖3 NaCl脅迫對(duì)野生株與luxS基因缺失突變株存活率的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of NaCl stress on survival rates of the wild-type strain and its mutant

不添加NaCl時(shí)，在孵育的24 h中，兩株菌的存活率均有微弱下降，這可能是由于沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致其中某些細(xì)胞個(gè)體的衰亡（圖3a）。在2% NaCl條件下孵育24 h后，存活率低于不添加NaCl組，但兩株菌存活率仍能達(dá)到98%以上，且無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖3b），此結(jié)果表明：在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2%時(shí)，luxS基因?qū)υ摼昴褪躈aCl脅迫的影響不顯著。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于3%時(shí)，野生株對(duì)NaCl的耐受能力極顯著高于突變株（P＜0.01）。野生株在3%、4%、6%及8% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下脅迫24 h后存活率分別為97.95%、95.55%、95.10%和83.47%；而luxS基因缺失突變株的存活率分別為92.05%、89.13%、75.15%和67.46%（圖3c～f），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，luxS基因在L. plantarum菌株耐受NaCl脅迫中起作用。

2.3 luxS基因?qū)暝贜aCl脅迫下生長(zhǎng)的影響

由鹽耐受能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在8% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下菌株存活率顯著下降，表明該條件嚴(yán)重影響其存活能力，進(jìn)而抑制菌株生長(zhǎng)代謝，因此在后續(xù)研究中僅討論其他5 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度。由圖4可知，無(wú)論是野生株還是突變株，鹽脅迫均會(huì)在一定程度上延緩或抑制L. plantarum KLDS1.0391菌體的生長(zhǎng)。野生株在含2%NaCl的MRS中生長(zhǎng)16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期（圖4b），較不含NaCl延遲4 h（圖4a），但在穩(wěn)定期后的OD600nm值無(wú)顯著差異（P＞0.05）；而對(duì)于其他NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)，不僅到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間較不含NaCl時(shí)有所延遲，OD600nm值也顯著降低（P＜0.05）（圖4c～e）。對(duì)于luxS突變株，任何質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl脅迫均會(huì)延長(zhǎng)其進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間，且顯著降低菌體數(shù)量（P＜0.05）；生長(zhǎng)能力均弱于野生株，且差異顯著（P＜0.05）。而突變株相對(duì)于野生株而言，二者達(dá)到各生長(zhǎng)階段的時(shí)間幾乎保持一致，無(wú)延遲現(xiàn)象；但在達(dá)到穩(wěn)定期后，各NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下活菌數(shù)均為野生株大于突變株。在6% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，菌株在指數(shù)生長(zhǎng)階段維持較長(zhǎng)時(shí)間，表明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl脅迫嚴(yán)重影響了L. plantarum KLDS1.0391的生長(zhǎng)。野生株在含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后OD600nm值分別為1.767、1.766、1.657、1.588和1.182；突變株則分別為1.705、1.677、1.618、1.544、1.101。

圖4 NaCl脅迫對(duì)野生株與luxS基因缺失突變株生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of NaCl stress on growth of the wild-type strain and its mutant

2.4 luxS基因缺失對(duì)菌株在NaCl脅迫下細(xì)菌素合成能力的影響

隨著L. plantarum KLDS1.0391進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，野生株細(xì)菌素合成量逐漸增加，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后細(xì)菌素合成量最大，且隨著細(xì)菌的衰亡，細(xì)菌素合成能力也逐漸減弱（圖5a）；在2% NaCl脅迫下，細(xì)菌素合成量高于未添加NaCl（圖5b）；而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，則在一定程度上抑制細(xì)菌素的合成，NaCl脅迫下L. plantarum KLDS1.0391細(xì)菌素最大合成量的順序依次為：2% NaCl＞0% NaCl＞3% NaCl＞4% NaCl＞6% NaCl（圖5c～e）。對(duì)于突變株，雖然細(xì)菌素在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的合成趨勢(shì)與野生株相同，但是當(dāng)其面對(duì)NaCl脅迫時(shí)，細(xì)菌素合成能力均較未脅迫時(shí)有所降低，且隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高，細(xì)菌素合成量也逐漸下降，差異顯著（P＜0.05）。

圖5 NaCl脅迫對(duì)野生株與luxS基因缺失突變株細(xì)菌素合成的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of NaCl stress on bacteriocin biosynthesis of the wild-type strain and its mutant

2.5 luxS基因?qū)暝贜aCl脅迫下細(xì)菌素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖6 NaCl脅迫對(duì)野生株與luxS基因缺失突變株細(xì)菌素相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of NaCl stress on expression of bacteriocin biosynthesis-related genes in the wild-type strain and its mutant

根據(jù)上述細(xì)菌素合成能力研究結(jié)果，選取具有代表性的促進(jìn)細(xì)菌素合成的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、抑制細(xì)菌素合成的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%為研究對(duì)象，以未脅迫作為對(duì)照。結(jié)果表明：當(dāng)L. plantarum野生株及突變株分別在不含NaCl的MRS中培養(yǎng)24 h時(shí)，編碼細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因plnEF與調(diào)節(jié)細(xì)菌素合成相關(guān)基因plnD和plNC8HK表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）（圖6a）；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和4%時(shí)，luxS基因缺失導(dǎo)致基因plnEF、plnD和plNC8HK的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖6b、c）。結(jié)果表明，存在鹽脅迫時(shí)，luxS基因會(huì)影響L. plantarum KLDS1.0391中細(xì)菌素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響該菌在鹽脅迫條件下細(xì)菌素的合成。

3 討 論

許多發(fā)酵食品如發(fā)酵肉、酸菜、干酪等通常會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中添加一定量的NaCl，使得環(huán)境中的滲透壓升高，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)并引起生理?yè)p傷，這會(huì)在一定程度上對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)與代謝造成脅迫。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，無(wú)論野生株亦或是luxS基因缺失突變株，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，存活率均逐漸下降，這是由于當(dāng)環(huán)境滲透壓增大時(shí)，細(xì)胞中的K+和Na+含量不足，細(xì)胞失水無(wú)法維持正常平衡，當(dāng)水分活度降低到一定程度導(dǎo)致死亡[20]；而在較低NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下仍能維持較高的存活率可能因?yàn)檎{(diào)節(jié)因子如分子伴侶（GroEL、GroES、DnaK、DnaJ等），在面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的修復(fù)和折疊，以及甘氨酸甜菜堿等相似相容性物質(zhì)，取代水與生物大分子物質(zhì)結(jié)合，減少細(xì)胞失水，從而對(duì)細(xì)菌自身起到良好的保護(hù)作用[21]。

LuxS/AI-2 QS可以調(diào)控乳酸菌的多種代謝活動(dòng)，luxS是合成AI-2信號(hào)分子中重要酶的編碼基因，在調(diào)控中起著重要作用。當(dāng)luxS基因缺失時(shí)，L. plantarum KLDS1.0391對(duì)NaCl的耐受能力及NaCl脅迫下的生長(zhǎng)能力均較野生株顯著下降，表明luxS基因?qū)aCl脅迫抗性起重要作用。Gu Yue等[22]研究表明當(dāng)Lactobacillus fermentum 2-1在4.5% NaCl脅迫下生長(zhǎng)時(shí)，luxS基因及pfs基因的表達(dá)量分別上調(diào)4.2 倍和2.9 倍，表明luxS基因在面對(duì)NaCl脅迫時(shí)起到一定的積極調(diào)節(jié)作用；此外Lin Lin等[23]也通過(guò)研究表明當(dāng)luxS基因被破壞后，會(huì)抑制調(diào)節(jié)因子dps-1基因的表達(dá)，致使菌體無(wú)法抵抗環(huán)境壓力；同樣Van Kessel等[24]發(fā)現(xiàn)AI-2 QS系統(tǒng)參與了哈氏弧菌的滲透脅迫反應(yīng)系統(tǒng)，且滲透耐受系統(tǒng)甘氨酸甜菜堿操縱子betIBA-proXWV由群體信號(hào)誘導(dǎo)，因此與野生型相比，信號(hào)調(diào)節(jié)基因luxR缺陷型菌株抗性較弱。然而Park等[25]研究雖然也證明了LuxS/AI-2 QS信號(hào)對(duì)Escherichia coli O157：H7應(yīng)對(duì)滲透脅迫有一定作用，但是其結(jié)果表明在0.6 mol/L NaCl脅迫條件下，luxS缺陷型大腸桿菌生長(zhǎng)速率快于野生株，且對(duì)滲透脅迫耐受性強(qiáng)，這可能是由于luxS基因的缺失影響大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控，改變了甲硫氨酸生物合成途徑；同時(shí)rcsA可以激活多糖的合成，且該基因與sdiA（一種編碼AHLs QS調(diào)節(jié)因子LuxR的同源物質(zhì)基因）的表達(dá)相關(guān)，因此推測(cè)rcsA基因的表達(dá)差異可能是影響二者生理反應(yīng)的主要原因。近年來(lái)，關(guān)于luxS/AI-2 QS參與應(yīng)激反應(yīng)[26]的研究逐步增加，Lebeer等[27]研究表明Lactobacillus rhamnosus的luxS突變株在模擬胃液中的存活率下降，表明luxS基因?qū)ξ杆釕?yīng)激起關(guān)鍵作用；L. acidophilus的luxS突變株由于無(wú)法產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子，使得生物膜的合成能力受到嚴(yán)重影響，且對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附性僅為野生株的42%[28]。

細(xì)菌素是由核糖體合成的具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽，可以抑制某些同源微生物的生長(zhǎng)，可作為新型防腐劑或抑菌物質(zhì)。野生株在2% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)至穩(wěn)定期后細(xì)菌素活性較對(duì)照組顯著提高，而其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)細(xì)菌素活性則顯著降低，這與Lim[29]的結(jié)論相似，L. plantarum KC21在低濃度NaCl脅迫下對(duì)細(xì)菌素合成有一定促進(jìn)作用。然而當(dāng)面對(duì)環(huán)境中的NaCl脅迫時(shí)，不同菌株也有差異，如Lactobacillus casei CTC494在有NaCl脅迫的條件下細(xì)菌素活性均下降[30]；而Lactobacillus pentosus B96在8%質(zhì)量濃度NaCl脅迫時(shí)細(xì)菌素活性仍較正常培養(yǎng)時(shí)有所升高[31]。但對(duì)于相關(guān)機(jī)制目前尚未有明確定論，這可能由于適量NaCl可以改變細(xì)胞膜的通透性[32]，有利于細(xì)菌素的釋放；同時(shí)細(xì)菌素的分泌有多種途徑如Sec途徑、SRP途徑以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等，一定濃度NaCl脅迫下可能使得相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生改變[33]，增加了細(xì)胞分泌的效率，使得合成的細(xì)菌素更快的排出胞內(nèi)被檢測(cè)到相關(guān)活性。Man等[18]研究結(jié)果顯示，L. plantarum KLDS1.0391中含有一對(duì)組氨酸蛋白激酶plNC8HK與相應(yīng)調(diào)節(jié)因子plnD，并構(gòu)建了plNC8HK-plnD基因突變株，發(fā)現(xiàn)突變株在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)無(wú)細(xì)菌素活性檢出，這表明該雙組分系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌素的合成具有重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明luxS基因缺失突變株在各NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下細(xì)菌素活性低于野生株，說(shuō)明luxS基因顯著影響細(xì)菌素的合成，且進(jìn)一步實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，突變株中與細(xì)菌素合成相關(guān)基因plnD、plnEF及plNC8HK基因的表達(dá)量均低于野生株。Merritt等[34]研究發(fā)現(xiàn)luxS基因缺失使得Streptococcus突變株無(wú)法產(chǎn)生細(xì)菌素mutacin I，且編碼基因mutA的表達(dá)量也較野生株下調(diào)400多倍，位于操縱子下游基因的正調(diào)控基因mutR的表達(dá)量也顯著下調(diào)，同樣表明luxS基因?qū)?xì)菌素合成有重要意義。

細(xì)菌素作為生物防腐劑使用時(shí)，應(yīng)具備在鹽脅迫條件下有較好的生長(zhǎng)與細(xì)菌素合成能力。本研究表明：L. plantarum KLDS1.0391野生株具有較好的鹽耐受能力，在8% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下仍能保持80%以上的存活率，且在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl存在時(shí)可以顯著提高細(xì)菌素合成能力；當(dāng)luxS基因缺失時(shí)，其對(duì)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的耐受能力顯著降低，且在任一NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下突變株的生長(zhǎng)能力、細(xì)菌素合成能力均弱于野生株，細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)量也均顯著下降，說(shuō)明L. plantarum KLDS1.0391中的luxS基因參與鹽脅迫響應(yīng)且起著重要作用，這為脅迫下QS調(diào)控細(xì)菌素合成提供一定理論依據(jù)，同時(shí)為該菌株應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供理論支持。