郭楠楠，張 巖，李永波，張 濤，張雅倫，周 巍,*，王 紅,,*

（1.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050024；2.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071）

植物蛋白飲料目前已成為飲料市場上不可或缺的產品，“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”的特征使其越來越受消費者的喜愛，擁有廣闊的消費市場[1]。與此同時，一些不法商家為謀取利益在植物蛋白飲料中摻雜使假、以次充好，欺騙消費者，擾亂市場秩序等質量安全問題受到了社會的廣泛關注。傳統(tǒng)的定性檢測方法難以準確甄別摻假程度，因此建立精準的定量分析檢測方法意義重大。

在食品安全檢測領域，應用較為廣泛的分子生物學技術主要包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、DNA條形碼技術和實時熒光PCR技術等。常規(guī)PCR技術靈敏度高、特異性好[2]，DNA條形碼技術成本低、快速可靠[3]，均被廣泛用于食品中進行定性檢測；實時熒光PCR技術不僅可用于定性檢測，還可測定循環(huán)閾值（Ct值）和初始DNA模板濃度進行相對定量[4-5]。但這些技術卻無法滿足精準定量分析的需求，微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的出現(xiàn)為食品安全檢測帶來了新的方案。ddPCR是準確定量核酸的一門新興核酸擴增技術[6-7]，其利用有限稀釋分析和泊松分布分析來實現(xiàn)靶DNA拷貝數的絕對定量[8-10]，被稱為“第三代PCR”技術[11]。ddPCR不依賴標準曲線，對稀有事件檢測準確、靈敏，廣泛應用于拷貝數變異檢測分析[12-13]、單核苷酸多態(tài)性分析[14]、產前診斷[15-17]、轉基因食品檢測[18-20]和微生物檢測[21-23]等。

ddPCR技術的興起為解決食品的摻雜使假問題提供了思路，目前，ddPCR技術在肉源性食品真?zhèn)舞b別領域研究較多，而在植物源性食品真?zhèn)舞b別領域應用較少。在肉類摻假研究中，王珊等[24]建立了羊肉制品中羊肉和豬肉的定量檢測方法，完成了ddPCR技術和熒光PCR技術的比較；Cai Yicun[25]、苗麗[26-27]、陳晨[28]等分別研究豬肉和雞肉產品、肉及肉制品中豬牛源和羊源成分、羊肉和豬肉制品的定量分析方法。在植物源性食品真?zhèn)舞b別中，楊碩等[1]采用多重ddPCR技術，通過單位質量下靶基因拷貝數之比換算植物源性成分投料比，完成了核桃露中核桃、大豆成分的定量檢測研究。

本研究在前人的基礎上探索植物及植物蛋白飲料（杏仁露）中杏仁和花生的定量檢測方法，基于ddPCR技術建立兩物種質量與拷貝數之間的計算公式，進行特異性、人為摻假樣品和市售樣品的檢驗，確定該方法的準確性和適用性，達到定量分析和甄別摻假的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏仁、花生購自石家莊大型超市；10 個品牌12 個批次的杏仁露購自石家莊大型超市和農貿市場。

深加工食品DNA提取試劑盒（非離心柱型） 天根生化科技（北京）有限公司；氯仿 北京酷來博科技有限公司；異丙醇、無水乙醇（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分析研磨機 德國IKA公司；AdVantage Pro真空冷凍干燥機 美國VirTis公司；Milli-Q Integral 3純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Millipore公司；SHA-AD恒溫振蕩器 金壇市華城敏科實驗儀器廠；1-15PK冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司；QX200 ddPCR微滴生成儀、微滴讀取儀、S1000 thermal cycler基因擴增儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

杏仁、花生：用分析研磨機進行初步研磨于超低溫真空冷凍干燥機中凍干，用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末，此樣品用作本研究的模板樣品及摻假模型的制備。

市售杏仁露：分裝于玻璃容器內于超低溫真空冷凍干燥機中凍干，用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末，此樣品用于實際檢測分析。

樣品制備過程中注意防止交叉污染。

1.3.2 DNA提取

梯度稱取10～100 mg杏仁、花生的模板樣品，采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法進行DNA的提?。?）取梯度稱取的模板樣品至滅菌離心管中，加入500 μL的緩沖液GMO1和20 μL的Proteinase K（20 mg/mL），振蕩混勻；2）56 ℃孵育1 h，其間每隔15 min上下顛倒混勻一次；3）加入200 μL緩沖液GMO2和400 μL氯仿，振蕩混勻，靜置10 min；4）12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液；5）向上清液中加入0.7 倍體積的異丙醇，充分混勻后12 000 r/min離心3 min，小心棄上清液；6）加入700 μL 70%的乙醇溶液，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清液；7）重復6）；8）于室溫開蓋放置，晾干殘留的乙醇；9）加入50 μL洗脫緩沖液TE，吹吸混勻，即可得到基因組DNA溶液，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 特異性引物和探針

根據GenBank中公布的杏仁過敏源性成分Pru du1基因序列，通過軟件Primer 5.0和PRIMER設計杏仁源性的特異性引物和探針序列Almond1～5；花生源性和真核生物18S rRNA內參照基因的引物和探針序列參考國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準[29-30]。本實驗所用引物和探針（表1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.4 微滴式數字PCR反應程序

20 μL反應體系：ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）10 μL，上下游引物各1.2 μL（900 nmol/L），探針0.4 μL（250 nmol/L），DNA模板4 μL，剩余用ddH2O補足。用微滴發(fā)生器生成微滴，進行普通PCR反應。PCR反應條件：95 ℃、10 min；94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min。最后用微滴分析器分析擴增產物。發(fā)生微滴過程中注意避免產生氣泡。

1.3.5 特異性分析

基于實時熒光PCR和數字PCR技術對特異性設計序列進行初步篩選，將初篩所得引物以無菌雙蒸水作為空白對照，分別選用植物源性物種杏仁、花生、核桃、大豆、榛果、芝麻、腰果、開心果、松子、葵花籽的DNA為模板進行數字PCR檢測，驗證引物的特異性。

1.3.6 杏仁和花生質量與拷貝數計算公式的確定

1.3.6.1 兩物種質量與DNA含量的關系

分別準確稱取10 個質量梯度的杏仁和花生（質量依次從10～100 mg）樣品，提取植物基因組DNA，用NanoDrop 2000測定所提DNA的濃度。每個梯度實驗進行3 次重復。相關系數R2用Origin 9分析生成。

1.3.6.2 兩物種DNA含量與DNA拷貝數的關系

為摸索DNA含量與拷貝數的線性關系，將提取好的杏仁和花生DNA進行梯度稀釋，分別稀釋為5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng/μL，以ddH2O為空白對照，取4 μL DNA進行ddPCR檢測。每個梯度實驗進行3 次重復。相關系數R2用Origin 9分析生成。

1.3.7 方法驗證實驗

為驗證所建立的ddPCR方法的準確性，在80 mg的質量范圍內建立杏仁和花生已知混合比例的摻假模型（杏仁和花生的最低質量分數均為6.25%），按1.3.2節(jié)的方法提取各混合樣品的DNA，將提取的DNA進行30 倍稀釋，取4 μL進行ddPCR檢測，進行3 次重復。

1.3.8 檢測方法的實際應用

10 個不同品牌12 個批次的杏仁露，按1.3.1節(jié)的方法進行前處理，按1.3.2節(jié)的方法提取DNA，用建立的ddPCR定量分析方法對杏仁露中杏仁和花生源性成分的質量進行檢測分析，進行3 次重復，進一步驗證本研究所建方法的準確性和實際適用性。

1.4 數據分析

采用Origin 9對實驗數據進行統(tǒng)計學分析和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 植物源性分析

用真核生物18S rRNA通用引物分別對杏仁、花生模板樣品和12 個市售樣品的DNA進行普通PCR擴增，并進行2%瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，空白對照、陰性對照均未出現(xiàn)擴增條帶，杏仁、花生和樣品DNA均出現(xiàn)大小140 bp左右的目的條帶，證明DNA提取成功，適宜進行后續(xù)PCR擴增反應。

圖1 植物源性成分通用引物PCR結果Fig. 1 PCR results obtained with the 18S rRNA primers and probe

2.2 引物和探針的特異性檢測結果

基于實時熒光PCR技術對杏仁引物進行初步篩選，結果顯示引物Almond1、2 對杏仁模板DNA均有明顯擴增曲線；將這2 對引物以杏仁DNA為模板進行ddPCR檢測分析，結果顯示引物Almond1能更好地區(qū)分陰、陽性微滴，初步確定Almond1為杏仁的特異性引物。在此基礎上，選擇多種常見植物物種作為DNA模板對杏仁、花生引物進行進一步的特異性檢測分析，ddPCR結果（圖2、3）顯示本研究選用的杏仁和花生的引物和探針特異性良好，與其他植物物種均無交叉反應，適用于杏仁和花生的定量檢測。

圖2 杏仁引物和探針的特異性檢測Fig. 2 Specificity evaluation of apricot kernel primer-probe system

圖3 花生引物和探針的特異性檢測Fig. 3 Specificity evaluation of peanut primer-probe system

2.3 DNA提取及含量的測定結果

為考察杏仁、花生質量與DNA含量的關系，各提取10 個質量梯度（10～100 mg）杏仁和花生的DNA，測得DNA含量。每個梯度各重復測得DNA含量的變異系數最大為4.13%，差異較小。取3 次重復實驗的平均值進行線性擬合，結果顯示杏仁在10～100 mg的質量范圍內與DNA含量呈明顯的線性關系，花生在10～80 mg的質量范圍內與DNA含量呈明顯線性關系（圖4）。兩物種的質量與其DNA含量呈明顯線性關系，杏仁和花生的相關性系數R2分別為0.997和0.994。

圖4 杏仁（A）和花生（B）質量與DNA含量的關系Fig. 4 Linear relationship between plant quantity and nucleic acid contents of apricot kernel (A) and peanut (B)

2.4 DNA含量和DNA拷貝數的關系

將提取的杏仁、花生DNA分別進行梯度稀釋，取4?μL稀釋后的DNA進行ddPCR檢測，每個梯度實驗進行3 次重復，擴增結果如圖5所示。每個梯度各重復所得DNA拷貝數的變異系數最大為4.72%，差異較小。取DNA拷貝數的平均值進行線性擬合，結果顯示杏仁稀釋質量濃度在5～50 ng/μL范圍內、花生稀釋質量濃度在5～100 ng/μL范圍內，隨著DNA含量的增加，DNA拷貝數相應增加，兩者呈現(xiàn)一定的線性關系（圖6），杏仁和花生線性相關系數R2分別為0.997和0.999。

圖5 梯度DNA含量條件下的杏仁（A）和花生（B）拷貝數Fig. 5 DNA copy numbers of apricot kernel (A) and peanut (B) at different nucleic acid contents

圖6 杏仁（A）和花生（B）DNA含量與DNA拷貝數的關系Fig. 6 Linear relationship between nucleic acid content and DNA copy number of apricot kernel (A) and peanut (B)

2.5 杏仁和花生質量與拷貝數計算公式的建立

根據杏仁、花生質量和DNA含量、DNA含量和DNA拷貝數之間的線性關系，分別以DNA含量為中間換算值，計算得出兩物種質量與DNA拷貝數之間的公式，M杏仁=0.13C+1.24，M花生=0.081C-0.63，其中，M為植物源性成分的質量（mg），C為DNA拷貝數（copies/μL）。

2.6 方法驗證實驗結果

分別提取已知比例混合樣品的基因組DNA，30 倍稀釋后，取4 μL進行ddPCR檢測，進行3 次重復測定，分析各重復間變異系數，將測得的拷貝數取平均值代入本研究建立的計算公式中得到測得杏仁和花生的質量。結果顯示，各重復間變異系數均小于15%，混合樣品中杏仁、花生的測得值與實際值基本一致，最大相對誤差為-12.86%（表2），在統(tǒng)計學許可范圍內。通過對已知摻假模型的檢測，驗證本研究所建立的ddPCR精準定量方法的準確性，表明該方法可有效應用于對市售杏仁露樣品的檢測。

表2 已知比例摻假模型分析結果Table 2 Results of quantification of known samples

2.7 方法應用結果

利用本研究建立的ddPCR方法，對12 個市售杏仁露中的杏仁和花生源性成分進行檢測分析，取3 次重復實驗平均值進行計算，各重復間差異較小，變異系數均小于15%。如表3所示，實驗測得杏仁露2的杏仁含量最高（90.93%），杏仁露3中未測得杏仁源性，杏仁露10、11中測得杏仁含量極少，杏仁露1、9中測得微量的花生，杏仁露12中測得杏仁含量較少（5.22%）而花生含量較多（47.61%）。這一系列的檢測結果表明市售杏仁露中存在不同程度的摻假現(xiàn)象。

表3 市售樣品檢測結果Table 3 Detection of commercial samples

3 結論與討論

本研究采用ddPCR技術探索杏仁露中杏仁和花生的定量檢測方法，通過建立質量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數之間的線性關系，換算出杏仁、花生質量與DNA拷貝數的計算公式，建立了可靠的定量分析方法。

本研究中將杏仁、花生原料和市售杏仁露進行凍干處理并研磨成粉，采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法提取DNA，提高了提取效率，且多次重復實驗結果中杏仁、花生的質量與DNA含量均呈明顯線性關系。該提取方法將原料與產品的提取方法一致化，保證了本研究所建立計算公式的適用性。

基于ddPCR技術建立了杏仁、花生的計算公式，通過已知比例摻假模型驗證了該方法體系的準確性。在摻假模型中，混合樣品的總質量為80 mg，杏仁和花生的最低摻入量均為5 mg（6.25%），混合樣品中杏仁、花生的實驗測得含量與其真實含量相差不大，其中人為摻入量越小相對誤差值越大，最大誤差為-12.86%。表明該方法能對杏仁、花生源性進行準確定量，可有效應用于市售杏仁露的定量檢測。

對市售的10 個品牌12 個批次的杏仁露樣品進行檢測分析，其中，杏仁露2測得杏仁質量分數最高，占90.93%；杏仁露3中杏仁質量分數最低，為0%且并未測得花生源性，判斷該樣品可能摻假其他物種；杏仁露9測得杏仁質量分數不到10%；杏仁露10和11的杏仁質量分數極少，占2%左右；杏仁露12中測得杏仁質量分數為5.22%但花生質量分數為47.61%，可判斷其為惡意摻假；杏仁露1和9中測得花生含量近乎為零，而實時熒光PCR檢測1、9的結果均為檢出花生源性成分，判斷可能是生產過程中的無意帶入而非惡意摻雜。檢測結果表明市售杏仁露中存在摻假現(xiàn)象，且摻假程度不一，本研究建立的定量分析方法可準確區(qū)分惡意摻假與無意摻雜，適宜推廣應用。

ddPCR的每個反應中，總微滴數均大于13 000，檢測有效，確保了本研究中定量方法的準確性。

本研究中定量方法的建立、驗證和實際應用中各重復實驗之間差異較小，變異系數均小于15%，在統(tǒng)計學許可范圍內。

本研究建立的ddPCR定量檢測體系準確可靠、靈敏度高、重復性好，可有效甄別市售杏仁露中的無意摻雜和惡意假冒偽劣問題，適合用于常規(guī)的量化檢測分析。該方法實現(xiàn)的精準定量檢測，可有效保護植物源性成分過敏人群，打擊制假摻假的不法商家，保護消費者權益，為植物蛋白飲料的市場監(jiān)管提供了新思路。

與此同時，該方法也可應用于其他植物及植物蛋白飲料的定量檢測，并有望實現(xiàn)多種植物源性成分的同時定量，建立更健全的定量檢測體系，監(jiān)控植物蛋白飲料的摻假問題，維持市場秩序，為市場監(jiān)管提供技術保障。