鄭 嵐，馬耀宏*，孟慶軍，王丙蓮，楊俊慧，劉慶艾，彭 耀，韓 芳

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103）

干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）為革菌屬真菌，珍貴稀少，僅分布在我國滇中高海拔地區(qū)的弱酸性紅壤地面上，與松樹有外生菌根關(guān)系，難以實現(xiàn)人工栽培[1-3]。干巴菌不僅異香濃郁、口味極佳，而且具有提高免疫力、抗氧化等保健功效[4-6]。每年干巴菌上市時總是供不應(yīng)求，導(dǎo)致無序亂采現(xiàn)象嚴(yán)重，產(chǎn)量逐年下降，價格逐年升高。由于其分布的局限性，國內(nèi)外對干巴菌的研究極為有限，并且多集中在干巴菌的分類、菌種分離、菌種鑒定和生態(tài)環(huán)境等方面。因此，干巴菌是一種具有極高經(jīng)濟價值及營養(yǎng)價值的亟待研究開發(fā)的菌種資源。

食用真菌多糖是食用真菌的主要活性成分之一，具有抗氧化[7]、提高免疫力[8-9]、抗癌癥[10]、降血脂[11]、保護肝臟[12]、促進腸道有益菌群生長[13]等廣泛的生物活性，是被認(rèn)可的沒有副作用的天然健康的功能食品[14-16]。通過液體發(fā)酵途徑制備干巴菌多糖是干巴菌資源開發(fā)的一條有效途徑。其中干巴菌多糖的發(fā)酵條件、提取工藝是其有效利用的前提條件，而對干巴菌多糖結(jié)構(gòu)和活性的研究是其開發(fā)利用關(guān)鍵點，尋找有效的提高多糖活性方法以及簡單、準(zhǔn)確的多糖結(jié)構(gòu)分析方法具有重要意義。

本研究對干巴菌的產(chǎn)糖培養(yǎng)基進行了優(yōu)化；利用Plackett-Burman（PB）試驗及響應(yīng)面試驗設(shè)計方法，優(yōu)化了干巴菌菌絲體多糖的超聲提取工藝；采用酶水解和酸水解方法，進一步提高了多糖的抗氧化活性；利用逐級酸水解結(jié)合柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法的實驗設(shè)計，分析多糖水解過程中單糖殘基的解離規(guī)律，進而推斷單糖殘基在糖鏈結(jié)構(gòu)中的分布規(guī)律。本研究建立了基于水解過程的多糖結(jié)構(gòu)分析方法，并將沒有成功栽培的干巴菌通過液體發(fā)酵技術(shù)獲得有價值的多糖產(chǎn)物，從而使干巴菌的資源利用變得切實可行。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干巴菌TG-01，由山東省科學(xué)院生物研究所分離保存。

2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；蝸牛酶北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；標(biāo)準(zhǔn)單糖（葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；溴化鉀碎晶美國Thermo公司。其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-CF組合式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津制作所；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎機、Scientz-18ND立式冷凍干燥機 上海新芝生物技術(shù)研究所；5804R離心機德國Eppendorf公司；Dynex Spectra MR酶標(biāo)儀 美國Dynex Technologies公司；SGD-IV全自動還原糖測定儀山東省科學(xué)院生物研究所；LE204E電子天平、S220臺式pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1260 HPLC儀 美國安捷倫科技有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 干巴菌產(chǎn)糖培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.1%、瓊脂2%；種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.1%；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（A）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.1%；淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基（B）：淀粉5%、NaNO30.33%、(NH4)2SO40.31%、MgSO4·7H2O 0.025%、FeSO4·7H2O 0.001%、KH2PO40.1%；酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基（C）：酵母提取物0.5%、蛋白胨0.15%、葡萄糖5%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.03%；葡萄糖玉米漿培養(yǎng)基（D）：葡萄糖3%、玉米漿0.84%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.025%；葡萄糖玉米漿尿素培養(yǎng)基（E）：葡萄糖3%、玉米漿0.8%、尿素0.1%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.03%；葡萄糖玉米漿氯化鈉培養(yǎng)基（F）[17]：葡萄糖3%、玉米漿0.8%、尿素0.1%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.03%、NaCl 0.5%。

1.3.1.2 干巴菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)

將斜面保藏的干巴菌TG-01接種于活化培養(yǎng)基平板中，25 ℃培養(yǎng)5 d，取0.5 cm2活化菌種接入種子培養(yǎng)基中，于搖床振蕩培養(yǎng)6 d（25 ℃，130 r/min），即為種子液。取0.5 mL種子液分別轉(zhuǎn)接入馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基、酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖玉米漿培養(yǎng)基、葡萄糖玉米漿尿素培養(yǎng)基、葡萄糖玉米漿氯化鈉培養(yǎng)基中，于搖床振蕩培養(yǎng)7 d（25 ℃，130 r/min），每種培養(yǎng)基5 個重復(fù)。

1.3.1.3 干巴菌多糖的提取[18]

將培養(yǎng)物離心（8 000 r/min，10 min，4 ℃），分別用pH計和還原糖測定儀測定上清液中的pH值和殘?zhí)呛?。將菌絲體沉淀用去離子水洗滌3 次后置于55 ℃烘箱中烘干，稱質(zhì)量，粉碎。菌絲體粉末以1∶20比例加入去離子水，超聲破碎（300 W，10 min），置于水浴鍋中90 ℃浸提2 h，離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃）取上清液。重復(fù)提取3 次，合并上清液并減壓濃縮至1/2～2/3體積，加入2 倍體積95%乙醇溶液，室溫靜置過夜，離心（8 000 r/min，10 min，4 ℃），沉淀于55 ℃烘箱中烘干并粉碎，即為干巴菌菌絲體多糖。

1.3.1.4 多糖得率的測定

苯酚-硫酸法測定多糖含量[19]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取2 mL不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸溶液，搖勻后靜置20 min，于波長490 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出回歸方程。樣品測定：將多糖溶解于去離子水中（50 ℃，2 h），離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取2 mL上清液于試管中，加入1 mL 6%苯酚，以下操作同“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”，3 次重復(fù)取平均值，根據(jù)回歸方程得出多糖質(zhì)量濃度。多糖得率和多糖產(chǎn)量按公式（1）、（2）計算：

多糖產(chǎn)量/（g/L）=多糖得率/%×菌絲產(chǎn)量/（g/L） （2）

1.3.2 干巴菌多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.2.1 PB試驗

表1 PB試驗因素和水平Table 1 Factors and levels used in PB design

選取影響干巴菌多糖得率的因素為響應(yīng)變量（X），以干巴菌多糖得率為響應(yīng)值（Y），用軟件Design Expert 8.0.6設(shè)計PB試驗，選出對多糖得率有顯著影響的因素。PB試驗選取因素和水平見表1。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗原理及PB試驗結(jié)果，選取超聲功率、超聲時間、醇沉倍數(shù)作為響應(yīng)變量（X），以干巴菌多糖的得率為響應(yīng)值（Y），進行響應(yīng)面試驗分析。響應(yīng)面試驗因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in response surface design

1.3.3 多糖的純化

將干巴菌多糖用去離子水溶解，離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃），上清液采用Sevag法去蛋白（氯仿-正丁醇，5∶1，V/V）[20]，重復(fù)多次，至乳化層消失且波長280 nm處無蛋白質(zhì)吸收峰為止。用0.45 μm微孔濾膜過濾后加于DEAE-52纖維素陰離子交換柱（1.6 cm×30 cm）中，用0、0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，流速為1 mL/min，2 mL每管收集，用苯酚-硫酸法逐管進行檢測，收集主要洗脫組分，凍干，溶解后加于Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱（1.6 cm×50 cm）中，去離子水洗脫，流速為0.1 mL/min，2 mL每管收集，用苯酚-硫酸法逐管進行檢測，并分別以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。收集主要組分凍干，采用苯酚-硫酸法測定凍干組分的總糖含量。

1.3.4 FTIR分析

將干燥的多糖樣品與KBr混合研磨后壓片，用FTIR儀進行紅外光譜測定，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.5 酶水解產(chǎn)物抗氧化能力的測定

1.3.5.1 酶水解產(chǎn)物的制備

分別稱取適量干巴菌多糖于離心管中，加入10 mL去離子水，混勻，用乙酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6。

纖維素酶水解：分別加入1%、5%、10%的纖維素酶，50 ℃水浴5 h（命名為EIPS-C1、EIPS-C2、EIPS-C3）。

蝸牛酶水解：分別加入1%、5%、10%的蝸牛酶，35 ℃水浴5 h（命名為EIPS-S1、EIPS-S2、EIPS-S3）。空白對照于50 ℃水浴5 h（命名為EIPS）。水解結(jié)束后，100 ℃水浴10 min，使酶失活，并調(diào)節(jié)pH值為7。離心（15 000 r/min，15 min，4 ℃）取上清液。

1.3.5.2 酶水解產(chǎn)物抗氧化能力的測定

還原力的測定[21]：取1 mL樣品于試管中，加入2.5 mL磷酸鈉鹽緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）和1 mL鐵氰化鉀溶液（10 g/L），混勻，50 ℃水浴20 min，然后加入2 mL三氯乙酸（100 g/L）和1.2 mL三氯化鐵溶液（1 g/L），混勻后于波長700 nm處測定吸光度。用2,6-二叔丁-4-甲基苯酚作為陽性對照。

ABTS陽離子自由基清除能力的測定[22]：實驗組：將ABTS溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（4.9 mmol/L）等體積混合，避光靜置20 h，用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）稀釋，使其在波長734 nm處吸光度為0.7±0.02，即為ABTS工作液。取ABTS工作液3 mL，樣品1 mL于試管中，室溫避光反應(yīng)6 min，于波長734 nm處測定吸光度A。實驗對照組：將ABTS工作液換為磷酸鈉鹽緩沖液，測得吸光度為AC?？瞻讓φ战M：將樣品換為水，測得吸光度為AB。ABTS陽離子自由基清除率按公式（3）計算：

DPPH自由基清除能力的測定[23]：實驗組：取2 mL樣品和2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L）于試管中，混合均勻后避光反應(yīng)30 min，離心（5 000 r/min，10 min，4 ℃），上清液于波長517 nm處測定吸光度A。實驗對照組：將DPPH-乙醇溶液換為乙醇溶液，測得吸光度為AC。空白對照組：將樣品替換為去離子水，測得吸光度為AB。DPPH自由基清除率按公式（4）計算：

1.3.6 逐級酸水解產(chǎn)物抗氧化能力的測定

1.3.6.1 逐級酸水解產(chǎn)物的制備

分別稱取適量干巴菌多糖于7 只安培瓶中（編號依次為1～7號），1～6號管加入10 mL硫酸溶液，按表3進行處理，使酸水解強度逐級提高，充入氮氣并封口，置于100 ℃水浴中，分別命名為AIPS-1～AIPS-6。7號空白對照加入去離子水，50 ℃處理2 h（命名為AIPS）。水解結(jié)束后，離心（15 000 r/min，15 min，4 ℃）取2 mL上清液，用NaOH溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至7，定容至5 mL，離心（15 000 r/min，15 min，4 ℃），上清液即為逐級酸水解產(chǎn)物。

表3 硫酸處理濃度及時間Table 3 Concentrations and times of sulfuric acid treatment

1.3.6.2 逐級酸水解產(chǎn)物抗氧化能力的測定

還原力、ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力的測定：方法同1.3.5.2節(jié)。

總抗氧化能力的測定：向試管中加入0.2 mL樣品和2 mL的P溶液（含0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨），95 ℃水浴90 min，于波長695 nm處測吸光度。

超氧陰離子自由基清除能力的測定[24]：向試管中加入1 mL樣品溶液及2 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2，50 mmol/L）混合均勻，25 ℃水浴20 min，結(jié)束后加入25 ℃水浴預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.4 mL（5 mmol/L），迅速混勻并于波長325 nm處每隔20 s測定一次吸光度，持續(xù)3 min。以去離子水替代樣品作為空白對照。超氧陰離子自由基清除率按公式（5）計算：

式中：S0為空白對照吸光度的斜率；S為樣品吸光度的斜率。

羥自由基清除能力的測定[25]：向試管中依次加入1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L），1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL多糖樣品，1 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol/L）混合均勻，37 ℃水浴30 min，離心（5 000 r/min，10 min），取上清液于波長510 nm處測定吸光度A。VC作為陽性對照。羥自由基清除率按公式（6）計算：

式中：A為樣品的吸光度；A0為去離子水替代樣品的吸光度。

1.3.7 多糖結(jié)構(gòu)中單糖殘基分布規(guī)律的測定

采用柱前衍生HPLC法分析逐級酸水解產(chǎn)物（AIPS-1～AIPS-6）中的單糖組成。配制2 mmol/L的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖）。取50 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測樣品（AIPS-1～AIPS-6）與50 μL PMP-甲醇溶液（0.5 mol/L）及50 μL NaOH（0.3 mol/L）混合均勻，70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入50 μL HCl（0.3 mol/L）和100 μL去離子水。向混合液中加入1 mL氯仿，渦旋混勻30 s隨后靜置5 min，吸取下層液棄去。從“加入1 mL氯仿”起重復(fù)操作4 次，即得衍生化的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品。

HPLC條件：流速為1 mL/min；檢測波長為245 nm；進樣量為20 μL；流動相為醋酸銨緩沖溶液（pH 5.5）-乙腈（77∶23，V/V）。根據(jù)逐級酸水解產(chǎn)物中的單糖種類及其物質(zhì)的量含量繪制單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量解離過程圖，分析多糖結(jié)構(gòu)中單糖殘基的分布規(guī)律，按公式（7）計算單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件作圖并進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干巴菌產(chǎn)糖培養(yǎng)基的優(yōu)化

利用不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)干巴菌，液體發(fā)酵7 d后的菌絲體產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量、pH值以及殘?zhí)呛恳妶D1。

圖1 培養(yǎng)基成分對干巴菌多糖產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of medium composition on polysaccharide yield

由圖1可知，采用不同液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)干巴菌，多糖產(chǎn)量由高到低為：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（A）＞葡萄糖玉米漿培養(yǎng)基（D）＞葡萄糖玉米漿尿素培養(yǎng)基（E）＞葡萄糖玉米漿氯化鈉培養(yǎng)基（F）＞淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基（B）＞酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基（C）。其中，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的多糖產(chǎn)量極顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.01）。采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)干巴菌7 d后，菌絲體產(chǎn)量可達(dá)7.56 g/L，多糖產(chǎn)量可達(dá)0.42 g/L，發(fā)酵結(jié)束時pH值為4.28，殘?zhí)钱a(chǎn)量為1.88 g/L。另外，以葡萄糖和玉米漿為主要碳、氮源的培養(yǎng)基也可以使干巴菌較為理想的生長并產(chǎn)生多糖。而以淀粉和硝酸鹽為主要碳、氮源的培養(yǎng)基，以酵母膏、蛋白胨和葡萄糖為主要碳、氮源的培養(yǎng)基不適合干巴菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2 干巴菌多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 PB試驗

2.2.1.1 PB試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 PB試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 PB design with experimental results

苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.009 2 x+0.152，R2=0.999 1。PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得多元一次回歸方程：Y=4.87+0.051X1+0.18X2-0.40X3-0.25X4-0.080X5-0.14X6+0.011X7+0.43X8+0.044X9，R2=0.963 9。

2.2.1.2 PB試驗的回歸模型方差分析

由表5可知，各因素對干巴菌多糖得率的影響順序為：醇沉倍數(shù)＞超聲功率＞超聲時間＞pH值＞提取時間＞提取溫度＞加水倍數(shù)＞醇沉?xí)r間＞提取次數(shù)。其中醇沉倍數(shù)、超聲功率、超聲時間為極顯著因素，pH值和提取時間為顯著因素，其余為不顯著因素。模型顯著（P＜0.05），失擬值不顯著（P＞0.05），并且，決定系數(shù)R2為0.963 9，調(diào)整型決定系數(shù)R2Adj為0.917 4，說明方程模型可信度較高，模型在整個回歸區(qū)域中擬合程度較好，能準(zhǔn)確的描述實驗結(jié)果。

表5 PB試驗的回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for the regression model from PB experiment

2.2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Response surface design with experimental and predicted polysaccharide yield

運用Design Expert 8.0.6軟件對表6響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：Y=6.77-0.039X1+0.091X2+0.15X3-0.096X1X2-0.047X1X3-0.029X2X3-0.68X12-1.03X22-0.57X32，R2=0.965 4。

2.2.2.2 響應(yīng)面試驗的回歸模型方差分析

表7表明，二次項（X12、X22、X32）對干巴菌多糖的得率有極顯著影響。模型極顯著（P＜0.01），失擬值不顯著（P＞0.05），R2為0.965 4，RA2dj為0.920 9，說明模型的擬合程度較好，可信度較高。

表7 響應(yīng)面試驗的回歸模型方差分析Table 7 ANOVA for the regression model from response surface design

2.2.2.3 響應(yīng)面圖及等高線圖

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 2 Response surface plot and contour plot showing interactive effects of factors on polysaccharide yield

如圖2所示，響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值（Y）在響應(yīng)變量（X）所選取的范圍內(nèi)存在最大值。由等高線圖可以看出，超聲時間和超聲功率之間的相互作用較強，等高線圖為橢圓形，而醇沉倍數(shù)與超聲時間、醇沉倍數(shù)與超聲功率之間的交互作用較弱。由響應(yīng)面模型獲得提取多糖的最優(yōu)工藝條件為超聲功率392.76 W、超聲時間10.22 min、醇沉倍數(shù)3.13，預(yù)測提取率為6.78%?？紤]到實際操作時的局限性，將工藝條件修正為超聲功率400 W、超聲時間10 min、醇沉倍數(shù)3 倍，在此條件下，干巴菌多糖的實際提取率為6.98%，與預(yù)測值基本一致。因此，通過Box-Behnken試驗得到的最優(yōu)提取工藝條件較為可靠，具有實際應(yīng)用價值。

2.3 干巴菌多糖的純化

圖3 干巴菌多糖的洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of T. ganbajun Zang polysaccharides

如圖3所示，干巴菌多糖經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析分離純化后獲得4 個純化組分，其主要組分（2號組分）經(jīng)G-100葡聚糖凝膠柱層析后為單個洗脫峰，表明2號組分分子大小相對均一，收集該組分凍干，并將其命名為IPS，IPS中總糖含量為916.36 mg/g。

2.4 FTIR測定結(jié)果

圖4 FTIR光譜圖Fig. 4 FTIR spectrum

由圖4可知，IPS的FTIR光譜圖表現(xiàn)出了多糖的典型特征吸收峰。3 600 cm-1和3 200 cm-1之間的強寬吸收峰表明存在O—H的伸縮振動[26]。2 900 cm-1附近的吸收峰由C—H鍵伸縮振動形成。1 734 cm-1附近的吸收峰是—COOH的C＝O伸縮振動產(chǎn)生的，說明IPS含有糖醛酸[27]。1 654 cm-1處的吸收峰與C＝O的伸縮振動有關(guān)。1 200～1 000 cm-1處的強吸收峰是由糖環(huán)振動、C—O—C糖苷鍵振動、C—OH側(cè)基的伸縮振動疊加所致。880 cm-1和840 cm-1處的特征吸收峰表明IPS同時含有β-糖苷鍵連接的吡喃糖和α-糖苷鍵連接的吡喃糖[28-29]。

2.5 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 纖維素酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖5 EIPS及其纖維素酶酶解產(chǎn)物（EIPS-C1、EIPS-C2、EIPS-C3）的抗氧化能力Fig. 5 Antioxidant capacities of EIPS and its cellulase hydrolysates(EIPS-C1, EIPS-C2 and EIPS-C3)

由圖5可知，EIPS及其纖維素酶酶解產(chǎn)物（EIPS-C1、EIPS-C2、EIPS-C3）的還原力、ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力隨著酶添加量的增加而逐步提高。EIPS及EIPS-C1、EIPS-C2、EIPS-C3在3 000 mg/L質(zhì)量濃度時的還原力分別為0.464、0.493、0.579、0.597。自由基的清除能力以EC50值表示，清除ABTS陽離子自由基的EC50值分別為290.59、292.08、265.75 mg/L和229.42 mg/L；清除DPPH自由基EC50值分別為2 066.63、2 147.93、1 335.97 mg/L和1 014.97 mg/L。EIPS-C3的還原力較EIPS提高24.78%（P＜0.01），EIPS-C3清除ABTS陽離子自由基、清除DPPH自由基的EC50值較EIPS分別降低21.05%（P＜0.01）、50.89%（P＜0.01）。

2.5.2 蝸牛酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖6 EIPS及其蝸牛酶酶解產(chǎn)物（EIPS-S1、EIPS-S2、EIPS-S3）的抗氧化能力Fig. 6 Antioxidant capacities of EIPS and its snailase hydrolysates(EIPS-S1, EIPS-S2 and EIPS-S3)

由圖6可知，EIPS及其蝸牛酶酶解產(chǎn)物（EIPS-S1、EIPS-S2、EIPS-S3）的還原力、ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力和酶的添加量之間表現(xiàn)出了明顯的量效關(guān)系。EIPS及EIPS-S1、EIPS-S2、EIPS-S3在3 000 mg/L質(zhì)量濃度時的還原力分別為0.464、0.658、0.711、0.894；清除ABTS陽離子自由基的EC50值分別為287.59、234.38、198.85 mg/L和133.07 mg/L；清除DPPH自由基EC50值分別為2 066.63、1 538.74、898.74 mg/L和449.44 mg/L。EIPS-S3的還原力較EIPS提高92.67%（P＜0.01），EIPS-S3清除ABTS陽離子自由基、清除DPPH自由基的EC50值較EIPS分別降低53.73%（P＜0.01）、78.25%（P＜0.01）。

由圖5、6可知，利用纖維素酶或蝸牛酶處理多糖后，多糖的抗氧化能力均有一定程度的提高。其原因包括以下2 個方面：一方面，多糖的生物活性與其分子大小及空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，分子質(zhì)量過大或分支過多均不利于多糖生物活性的發(fā)揮[30-31]，纖維素酶和蝸牛酶可以斷裂多糖鏈中的共價鍵，使其成為具有適中主鏈長度、支鏈頻率、分子質(zhì)量的多糖。另一方面，多糖鏈的斷裂能增加水解產(chǎn)物中具有還原性的活性端基數(shù)量，從而提高酶水解產(chǎn)物的抗氧化能力。

纖維素酶的酶切位點為β（1→4）糖苷鍵，蝸牛酶的酶切位點一般為β（1→3）糖苷鍵。比較可知，蝸牛酶較纖維素酶具有更明顯的處理效果，其原因可能為蝸牛酶是包含纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶等酶類的混合酶，多糖含有更多的蝸牛酶酶切位點。因此，該多糖結(jié)構(gòu)中含有β（1→4）糖苷鍵，并且可能含有β（1→3）糖苷鍵。

2.6 逐級酸解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖7 AIPS及其酸解產(chǎn)物（AIPS-1、AIPS-2、AIPS-3、AIPS-4、AIPS-5、AIPS-6）的抗氧化能力Fig. 7 Antioxidant capacities of AIPS and its acid hydrolysates (AIPS-1,AIPS-2, AIPS-3, AIPS-4, AIPS-5 and AIPS-6)

由圖7可知，AIPS及其逐級酸解產(chǎn)物（AIPS-1、AIPS-2、AIPS-3、AIPS-4、AIPS-5、AIPS-6）的還原力、總抗氧化能力、自由基清除能力隨著酸水解強度的增強而逐步提高。AIPS及酸解產(chǎn)物AIPS-6在2500 mg/L時的還原力分別為0.367、0.670，酸解后AIPS-6較AIPS提高了82.56%（P＜0.01）；總抗氧化能力分別為0.37、1.31，酸解后提高了254.05%（P＜0.01）；清除DPPH自由基EC50值分別為1 162.81 mg/L和554.86 mg/L，酸解后降低了52.28%（P＜0.01）；清除ABTS陽離子自由基的EC50值分別為100 mg/L和65.42 mg/L，酸解后降低了34.58%（P＜0.01）；AIPS清除羥自由基的能力和清除超氧陰離子自由基的能力較弱，在質(zhì)量濃度小于2 500 mg/L時沒有達(dá)到EC50值（即EC50值＞2 500 mg/L），而AIPS-6的EC50值達(dá)到572.93 mg/L和1 389.64 mg/L，較AIPS有了明顯提高（P＜0.01）。因此，酸水解處理可以顯著提高多糖的抗氧化能力，并且在一定范圍內(nèi)酸水解強度越強抗氧化能力越高。

2.7 多糖結(jié)構(gòu)中單糖殘基分布規(guī)律的分析

多糖在水解過程中其單糖殘基的解離規(guī)律與多糖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，處于支鏈末端及支鏈外側(cè)的單糖殘基更容易被水解游離出來，反之處于主鏈及支鏈內(nèi)側(cè)中的單糖殘基較難水解游離。本研究通過逐漸提高水解強度獲得逐級酸解產(chǎn)物，并檢測逐級酸解產(chǎn)物中單糖種類及其含量，繪制單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量解離過程圖，進而分析單糖殘基在多糖結(jié)構(gòu)中的分布。柱前衍生HPLC圖及單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量解離過程見圖8、9。

圖8 逐級酸解產(chǎn)物的柱前衍生HPLC圖Fig. 8 Pre-column derivatization HPLC of stepwise acid hydrolysates

圖9 單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量解離過程圖Fig. 9 Monosaccharide composition (in molar percentage) of stepwise acid hydrolysates

如圖8、9所示，AIPS幾乎不含游離單糖，只含有極微量的甘露糖。隨著硫酸濃度的提高和水解時間的延長，酸水解產(chǎn)物中游離出的單糖逐漸增多，并呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。低強度酸水解時，半乳糖和甘露糖最先游離出來，說明半乳糖和甘露糖構(gòu)成多糖的支鏈末端殘基，并且末端殘基主要由半乳糖構(gòu)成。隨著水解強度增大，半乳糖在所有單糖中所占的物質(zhì)的量比例逐漸降低，由93.03%下降到17.91%，說明半乳糖主要分布于支鏈外側(cè)及支鏈末端位置；葡萄糖的物質(zhì)的量比例由61.57%上升到68.84%，說明葡萄糖是多糖的主要單糖成分，并且葡萄糖更多的分布于支鏈內(nèi)側(cè)及主鏈核心位置；甘露糖隨著水解強度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，由6.97%上升到16.62%然后下降到11.83%，說明甘露糖更多的分布于支鏈內(nèi)側(cè)。另外，干巴菌胞內(nèi)多糖還含有微量鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及阿拉伯糖，這些單糖殘基零星的分布于糖鏈中。

3 結(jié) 論

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基是干巴菌的最適產(chǎn)糖培養(yǎng)基，干巴菌在該培養(yǎng)基中生長旺盛，培養(yǎng)7 d后菌絲體產(chǎn)量為7.56 g/L，多糖產(chǎn)量為0.42 g/L。采用PB試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化干巴菌多糖的提取工藝，結(jié)果表明，極顯著影響因素及其最優(yōu)條件為超聲功率400 W、超聲時間10 min、醇沉倍數(shù)3 倍，在該條件下干巴菌多糖的得率可達(dá)6.98%。FTIR分析表明，干巴菌多糖的構(gòu)型為β-糖苷鍵和α-糖苷鍵連接的吡喃糖。體外抗氧化實驗表明，干巴菌多糖具有良好的抗氧化活性，并且利用纖維素酶、蝸牛酶和硫酸水解多糖可以使多糖的抗氧化能力顯著增強，水解強度與抗氧化能力呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。由酶解實驗可以推測多糖結(jié)構(gòu)中含有β（1→4）糖苷鍵，并且可能含有β（1→3）糖苷鍵。逐級酸水解結(jié)合柱前衍生HPLC法分析多糖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：支鏈末端殘基以半乳糖為主，并含有部分甘露糖；半乳糖大多分布于支鏈外側(cè)及支鏈末端位置；葡萄糖是其主要單糖成分，主要分布于支鏈內(nèi)側(cè)及主鏈核心位置；甘露糖在支鏈內(nèi)側(cè)分布較多；另有微量葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及阿拉伯糖零星的分布于糖鏈中。該方法通過繪制多糖水解過程中單糖殘基的物質(zhì)的量百分含量解離過程圖直觀地反映了多糖結(jié)構(gòu)，創(chuàng)新了多糖結(jié)構(gòu)的分析方法。因此，本研究為干巴菌菌絲體多糖的資源化利用提供了理論基礎(chǔ)，并且發(fā)現(xiàn)酶水解和酸水解是提高多糖活性、分析多糖結(jié)構(gòu)的有效方法。