張利文 侯 慶 汪 玲 朱小東 曾彩虹 秦衛(wèi)松 劉志紅 陳朝紅

TYRO3受體絡氨酸激酶是一種單跨膜蛋白。TYRO3與其配體，生長停滯特異性基因6(GAS6)或蛋白S(PROS1)結合后，胞內(nèi)結構二聚化，誘導胞內(nèi)域的絡氨酸激酶域磷酸化［1］，從而激活下游的信號通路，介導細胞生長、存活、黏附、遷移、凋亡等生理病理過程［2－6］。TYRO3在多種組織中表達，并且在神經(jīng)系統(tǒng)中最突出。在腦組織中，TYRO3在內(nèi)皮細胞［7］、神經(jīng)元［8］、少突膠質(zhì)細胞［9］、海馬［3］及外周神經(jīng)系統(tǒng)施旺細胞［10］均有表達。缺氧情況下TYRO3可通過激活AKT信號通路保護鼠海馬神經(jīng)元減免于凋亡［3］。在造血系統(tǒng)中，TYRO3在樹突狀細胞［11］、自然殺傷細胞［12］、單核細胞和巨噬細胞［13］、血小板和巨核中［14－17］表達，可發(fā)揮調(diào)節(jié)血栓形成作用。免疫系統(tǒng)中，TYRO3可負性調(diào)節(jié)天然免疫細胞2型免疫反應的強度［11］。在生殖系統(tǒng)中，TYRO3在睪丸中的支持細胞和卵巢中的顆粒細胞中表達［18］。TYRO3也在肺，骨骼肌，肝臟，胰腺和心肌表達［19－20］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)［21］，TYRO3在腎小球中特異性表達于足細胞，大量白蛋白尿的糖尿病腎病患者和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者腎小球TYRO3 mRNA水平下降，腎小球中TYRO3 mRNA表達水平與糖尿病腎病患者估算的腎小球濾過率(eGFR)呈正相關，TYRO3作為足細胞保護性因子，在維持正常足細胞功能中發(fā)揮重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建穩(wěn)定遺傳的斑馬魚TYRO3純合突變體，為進一步研究其功能提供體內(nèi)模型。

斑馬魚的腎單位分子組成、結構和功能與高等哺乳動物后腎高度保守［22］，斑馬魚模型具有胚胎發(fā)育時間短，發(fā)育過程中胚胎透明，易于觀察表型缺陷和進行基因篩選等優(yōu)勢，越來越多的被應用于基因功能研究。目前在斑馬魚中最常用的抑制基因表達的方法包括胚胎注射Morpholino，RNAi、ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9系統(tǒng)效率高，脫靶率低，在斑馬魚的研究中逐漸被廣泛應用。

本研究通過CRISPR/Cas9構建穩(wěn)定遺傳的斑馬魚TYRO3純合突變體，并初步觀察TYRO3缺失對斑馬魚腎小球的影響。

材料和方法

斑馬魚飼養(yǎng)和繁殖 斑馬魚飼養(yǎng)于28.5℃水溫環(huán)境中，照明14h與黑暗10h交替。斑馬魚胚胎于28.5℃培養(yǎng)箱中孵化，每日更換培養(yǎng)液。

斑馬魚腎小球的分離 吸取5d的Tg(pod:GFP)的斑馬魚幼魚于1.5 ml的EP管中，置于冰上麻醉沉底后用含1%北美胎牛血清的PBS清洗一遍后用2.5 ml的注射器快速抽吸三次，將含碎裂斑馬魚的液體吸取到熒光顯微鏡下觀察，用移液器槍頭將帶綠色熒光的腎小球組織塊吸出加到消化液中37℃消化3 min后再次于熒光顯微鏡下將從組織分離下來的腎小球吸出加到RNA裂解液中。Tg(pod:GFP)的斑馬魚來自周衛(wèi)斌教授饋贈。

靶位點設計 在Ensemble網(wǎng)站找到斑馬魚tyro3蛋白編碼序列，用NCBI對蛋白序列進行blast，找到蛋白的保守功能域，在蛋白保守功能域對應的基因序列第5外顯子處設計基因突變位點，通過http://www．rgenome．net/網(wǎng)站分別對靶位點序列特征和脫靶可能性打分，選擇活性較高的single-guide RNA(sgRNA)并合成gRNA序列oligo:oligo A1:5'-GGTGAAGCTGACAGTGTCTC-3'oligoB1:5'-GAGACACTGTCAGCTTCACC-3';oligoA2:5'-GTCAGCGAGCAGCACTGGAT-3'oligoB2:5'-ATCCAGTGCTGCTCGCTGAC-3'。

轉錄模板合成 TYRO3 gRNA oligo退火，PCR反應體系包括 1 μl 100 μm oligo A，1 μl 100 μm oligo B ，5 μl 10×annealing buffer，43 μl H2O。反應程序:95℃ 開始反應，每 30s降 1℃。取 2 μg PDR274質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bas1(NEB公司)線性化后，純化(zymoclean Gel DNA Recovery kit)回收。取1 μl(5 ng/μl)線性化的 PDR274 質(zhì)粒與3 μl退火后的oligo用T4連接酶(NEB公司)16℃過夜連接。轉化入DH5α感受態(tài)細胞，挑單克隆，提取質(zhì)粒并測序鑒定。

sgRNA和Cas9編碼的mRNA體外轉錄TYRO3 gRNA體外轉錄模板是用限制性內(nèi)切酶Dra I將pDR274-TYRO3 gRNA載體線性化后純化回收作為模板，應用MaxiScript T7 Kit將1 μg模板體外轉錄成gRNA，純化回收(RNA clean＆concentrator TM－5)體外轉錄的gRNA。對于編碼Cas9的mRNA體外轉錄，我們使用PT3TS-nCas9n質(zhì)粒，XbaⅠ線性化后純化(DNA clean＆concentratorTM-5)。取 1 μg用于體外轉錄(mMESSAGE mMACHINE T3 kit)，轉錄產(chǎn)物純化(RNA clean＆concentrator TM－25)后用Nanodrop測量純度和濃度。

sgRNA和Cas9編碼mRNA顯微注射 將Cas9 mRNA(300 ng/μl)和 gRNA(10 ng/μl)共同顯微注射入野生型AB斑馬魚胚胎單細胞，28.5℃培養(yǎng)箱飼養(yǎng)。通過 PCR分析基因型，逐代篩選 F0，F(xiàn)1和F2。

靶位點序列PCR和瓊脂糖凝膠電泳 取1枚24h胚胎或者剪取部分成年斑馬魚尾加30 μL含1%蛋白酶(proteinase K)細胞裂解液(每100 ml包含:1M pH為8.0的Tris-HCl;4 ml 2 mM EDTA，200 μl Triton-100)混勻55℃ 1h，95℃ 5 min裂解基因組DNA。取1.5 μl裂解液作為PCR反應模板。PCR上下游引物分別設計在靶位點上下游100 bp左右的位置。上游引物序列:CTGGGACAATTCCACGCTAA，下游引物序列TGCTGAGTCAGAACAATGTAAGT。PCR 反應體系包括:5.7 μl ddH2O，0.3 μl primer 混合液(10 μmol/L)，1 μl基因組模板和 7.5 μl 2×EasyTaq supermix。反應程序:94℃ 3min;94℃30s，54℃ 15s，72℃ 30s，共 35 個循環(huán);72℃ 7 min。配制3%的瓊脂糖凝膠電泳，取5 μl PCR產(chǎn)物進行電泳。

結 果

TYRO3在斑馬魚腎小球上有表達 對腎臟有熒光標記的斑馬魚Tg(pod:GFP)進行腎小球的分離，RT-PCR檢測近端腎小管分子slc20a1a，遠端腎小管分子trpm7以及足細胞標記分子podocin，以對分離小球進行純度驗證(圖1A)。分離斑馬魚腎小球RT-PCR結果顯示TYRO3在斑馬魚腎小球上有表達(圖1B)。

圖1 分離斑馬魚腎小球，RT-PCR檢測腎小球TYRO3表達

通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變斑馬魚TYRO3基因 根據(jù)斑馬魚TYRO3蛋白的保守功能域，在其對應的基因序列第5外顯子處設計基因突變位點(圖2C)，并根據(jù)以下實驗流程進行操作(圖2A)。為確認gRNA的活性及靶位點突變類型，收集八個注射后胚胎(F0代)，裂解獲得基因組DNA后做PCR(圖2B)，雙條帶顯示有堿基的改變，有超過八分之一的雙條帶，說明gRNA活性有效。將PCR產(chǎn)物測序，測序后峰圖在target site PAM前4 bp出現(xiàn)套峰(圖2C)。證明造成了堿基的缺失。將非3倍數(shù)堿基缺失的F0代孵育至成年。

圖2 CRISPR/Cas9突變斑馬魚TYRO3基因

通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)得到穩(wěn)定遺傳的TYRO3基因突變的斑馬魚品系 為驗證這種堿基突變是可遺傳的，將同一批注射了sgRNA的斑馬魚胚胎恒溫28.5℃培養(yǎng)約3個月至性成熟后，分別從中取與野生型AB斑馬魚雌雄交配，收集每對斑馬魚產(chǎn)生的胚胎F1，恒溫培養(yǎng)至24h，每對隨機取8只胚胎做PCR，選取其中雙條帶的PCR產(chǎn)物分別做測序，檢測胚胎突變穩(wěn)定性。產(chǎn)卵的17對魚中有12對胚胎出現(xiàn)了雙條帶，并且雙條帶比率大于1/8，最終測序證實得到有兩種不同的非3倍數(shù)的堿基突變(圖3A、B)。將同一批的其余胚胎恒溫培養(yǎng)至性成熟，從同一種突變類型斑馬魚中分別取雌雄進行交配，得到包含有野生型、雜合型、純合型斑馬魚胚胎。上述胚胎培養(yǎng)至成年后分別剪每只斑馬魚尾鰭做PCR，選取其中單條帶測序，鑒定每條成魚基因型。一號突變型有43只斑馬魚進行了剪尾、PCR及測序，其有2條突變純合體，28條雜合體以及13條野生型。而二號突變型有103只斑馬魚進行了剪尾、PCR及測序，其有5條突變純合體，63條雜合體以及35條野生型。純合子基因型測序結果及峰圖(圖3B)，顯示堿基缺失均出現(xiàn)在同一位置，峰圖整齊，沒有出現(xiàn)雜峰，表明等位基因突變類型一致，即得到穩(wěn)定遺傳的TYRO3基因突變的純合斑馬魚品系。

圖3 通過PCR和測序鑒定基因型，篩選獲得TYRO3基因突變斑馬魚

TYRO3突變對斑馬魚的影響 為了研究TYRO3缺失對斑馬魚的影響，我們讓同一純合突變的雌雄魚交配，得到完全純合的TYRO3基因突變斑馬魚。結果顯示胚胎發(fā)育至3d時大約有30%的斑馬魚出現(xiàn)心包、卵黃囊及眼周的水腫，與野生型斑馬魚相比，TYRO3基因突變斑馬魚身體短小，身體稍微彎曲，其余部分胚胎表型相對正常。出現(xiàn)水腫表型斑馬魚從第三天就開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，至第五天已經(jīng)全部死亡，只剩余表型相對正常斑馬魚存活。我們隨機挑選幾條存活下來5d的子代胚胎送至電鏡檢查，結果顯示，TYRO3突變斑馬魚均出現(xiàn)了明顯的足突融合。

討 論

CRISPR/Cas9誘導基因組DNA雙鏈斷裂，通過末端非同源修復機制對斷裂的雙鏈DNA進行修復，從而引起堿基的缺失或者插入，并在基因編碼區(qū)內(nèi)產(chǎn)生移碼效應，導致蛋白質(zhì)翻譯提前終止。本實驗通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)得到穩(wěn)定遺傳的TYRO3基因突變的斑馬魚品系，考慮gRNA的脫靶，我們剛開始設計了兩條gRNA，而其中一條在注射24h，取胚胎做PCR進行活性驗證時發(fā)現(xiàn)，并未造成有效的堿基缺失，另一個gRNA 8個PCR中有4個出現(xiàn)雙條帶。測序結果顯示，其中有3個在緊靠PAM前4個堿基發(fā)生了缺失，另一個在PAM往前3個堿基處發(fā)生了6個堿基的缺失，F(xiàn)0代突變效率可達50%。通過F0代與野生型斑馬魚交配得到雜合突變體F1以及同一堿基缺失F1之間交配得到子代的測序證明，這種由gRNA造成的堿基缺失可穩(wěn)定的遺傳。但是值得注意的是，在對F1子代成年斑馬魚剪尾進行突變體篩選時，根據(jù)孟德爾遺傳定律，純合子突變數(shù)量應維持在25%，而本研究獲得的2個純合子都只占5%左右，嚴重低于遺傳定律，但雜合子與野生型之間的比例(2∶1)卻基本符合，提示TYRO3基因基因突變純合子有一大部分在生長過程中死亡。與之一致的是，TYRO3純合突變體之間的子代斑馬魚在3d時出現(xiàn)了明顯的身體水腫以及死亡，即使存活下來的斑馬魚也出現(xiàn)了明顯的足突融合，提示TYRO3缺失造成了斑馬魚足細胞損傷。

圖4 TYRO3突變對斑馬魚的影響

既往研究提示，TYRO3在腎臟的生理病理過程中可能發(fā)揮重要作用。Zhong等［23］發(fā)現(xiàn)TYRO3介導了PROS1抑制足細胞炎癥反應，發(fā)揮足細胞保護作用。PROS1通過激活TYRO3負性調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應，減輕細胞損傷［24－26］。而敲低 TYRO3 顯著降低了 PROS1的抗炎效應，提示 TYRO3在介導PROS1抑制足細胞炎癥中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，大量白蛋白尿的糖尿病腎病患者循環(huán)和尿液中可溶性TYRO3升高，高糖抑制體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞TYRO3 mRNA表達［27］。但上述研究未探索TYRO3在腎臟的功能。目前關于TYRO3在腎臟方面的研究幾乎沒有。本研究成功運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建穩(wěn)定遺傳的TYRO3基因突變的斑馬魚品系，為進一步研究TYRO3基因功能提供了體內(nèi)模型。值得注意的是，純合的TYRO3基因突變斑馬魚胚胎期只有30%出現(xiàn)明顯的腎臟損傷表型，雖然表型相對正常的斑馬魚電鏡下也出現(xiàn)了明顯的足突融合。這種表型嚴重程度的差異，是否是因為受同一家族另外成員或其他基因的影響而不同?據(jù)報道TYRO3和AXL可能會異二聚化后相互交叉磷酸化［28］，TYRO3磷酸化程度受AXL磷酸化水平影響，因此TYRO3在腎臟的功能其機制還有待進一步研究。