李王麗 佟 曉 陳 斌

宮頸鱗狀細胞癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡在50歲左右，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢[1-2]。宮頸鱗狀細胞癌的具體發(fā)病機制還不明確，病因包括遺傳、長期雌激素刺激、體質因素等[3]。現代研究表明宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生與發(fā)展是涉及多個遺傳變化多階段演化過程，其中癌癥相關基因的檢測有助于宮頸鱗狀細胞癌的診斷、預后和預測[4-5]。黏蛋白4(mucin 4,MUC4)是一種高分子量的糖基化蛋白，在正常的女性生殖道中均有表達，在宮頸癌中MUC4的表達量較正常的宮頸組織顯著上升[6-7]。內皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)也是一種酪氨酸激酶受體，可參與體內的多種反應，EGFR及其相關的信號通路可以作為宮頸癌患者的治療靶點[8]；其也能夠進一步激活該通路的下游因子從而促進腫瘤細胞的生長、增殖，侵襲和轉移，抑制腫瘤細胞凋亡[9-10]。本文采用免疫組織化學技術檢測MUC4、EGFR和p-AKT在宮頸鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中的表達，探討其在宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生與發(fā)展中的意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

采用回顧性、總結研究方法，2015年9月到2017年12月選擇在我院進行手術診治的宮頸鱗狀細胞癌患者120例的癌組織標本與癌旁組織標本作為研究對象，納入標準：術前未接受放療、化療及激素治療；有完整的臨床與病理資料；病理檢查診斷為宮頸鱗狀細胞癌；癌旁組織與離癌組織距離≥3 cm；醫(yī)院倫理委員會批準了此次研究。排除標準：伴隨有婦科內分泌疾病及生殖道炎癥；妊娠與哺乳期婦女；臨床與病理資料缺項。

在120例患者的組織標本中，年齡最小45歲，最大78歲，平均年齡(65.33±4.21)歲，年齡≥60歲60例；分化程度：高分化80例，中分化20例，低分化20例；臨床分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期40例，Ⅲ期20例；淋巴結轉移30例；肌層浸潤50例。

1.2 免疫組化方法

所有患者的癌組織標本與癌旁組織標本取材后，用10%的甲醛溶液固定12～24 h，石蠟包埋，制備成4 μm厚的石蠟切片。

兔抗人MUC4、EGFR和p-AKT多克隆抗體來自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB酶底物顯色劑來自廣州深達生物制品技術有限公司，超敏鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶染色法(S-P免疫組化法)廣譜免疫組化試劑盒來自廣州深達生物制品技術有限公司。

將切片組織37 ℃烤24 h，脫蠟后清洗3次。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，清洗3次后進行抗原修復，加入一抗，濕盒內4 ℃過夜。清洗后，加二抗37 ℃，30 min。DAB顯色，脫水封片后在光學顯微鏡觀察。取已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標

鏡下順序放大200倍，每張切片隨機選取10個視野。MUC4、EGFR和p-AKT蛋白表達陽性為胞質或胞核內出現棕黃色顆粒。染色強度陰性為0分、染色弱但強于陰性對照為1分、染色清晰為2分、染色強為3分。陽性細胞數<10%為0分，≥10%～30%為1分，>30%～60%為2分，>60%為3分。上述二種評分相加0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，3～6分為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MUC4、EGFR和p-AKT表達陽性率情況

癌組織中MUC4、EGFR和p-AKT表達陽性率分別為90.8%、74.2%和93.3%，癌旁組織分別為28.3%、36.7%和30.0%，對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織的MUC4、EGFR和p-AKT陽性表達情況(例，%)

2.2 MUC4、EGFR和p-AKT表達與臨床病理特征參數的相關性

在宮頸鱗狀細胞癌組織中，MUC4、EGFR和p-AKT表達陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結的轉移而顯著增高(P<0.05)。見表2。

2.3 MUC4、EGFR和p-AKT的相關性分析

在宮頸鱗狀細胞癌組織中，Spearman等級相關分析顯示MUC4與EGFR呈顯著正相關性(γ=0.563，P<0.05),MUC4與p-AKT呈顯著正相關性(γ=0.433，P<0.05)，EGFR與p-AKT呈顯著正相關性(γ=0.411，P<0.05)。見表3。

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌是嚴重危害女性健康的疾病，當前在我國的發(fā)病率有上升趨勢，已對女性的生命和健康造成了嚴重的威脅[11]。已有研究發(fā)現宮頸鱗狀細胞癌患者存在血糖異常，多伴隨有肥胖、高血壓、糖尿病等基礎疾病，其發(fā)生與發(fā)展是一個相對復雜的過程，也是多種因素綜合作用導致的病變[12-13]。

本研究顯示癌組織中MUC4、EGFR和p-AKT表達陽性率分別為90.8%、74.2%和93.3%，癌旁組織分別為28.3%、36.7%和30.0%，對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MUC4對上皮細胞的完整性和更新起著重要作用，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤中均表達異常[14]，但其具體機制目前尚不清楚。EGFR在多種實性腫瘤中表現出高度活性，在宮頸鱗狀細胞癌的患者體內出現了EGFR基因擴增、表達上調。EGFR是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，其前體在胞質內質網中經修飾形成成熟EGFR，膜受體與配體結合形成受體復合物，經內陷、吞飲進入胞質，于溶酶體內降解，受體再循環(huán)至膜上[15-16]。研究表明，約80%的宮頸癌、50%的卵巢癌、60%的子宮內膜癌、70%的外陰癌組織中存在EGFR的過度表達，遠高于正常組織，其中以宮頸、外陰的鱗狀上皮腫瘤中過表達最明顯[17]。Akt經磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-3-磷脂酰肌醇依賴性激酶-1(PDK1)，整合素連接激酶等作用后發(fā)生2個位點的磷酸化，從而被激活，p-Akt為其活化形式，在胰腺癌、乳腺癌、大腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌都呈現高表達狀況[18]。

表2 MUC4、EGFR和p-AKT陽性表達與臨床病理特征參數的相關性(例，%)

表3 宮頸鱗狀細胞癌組織MUC4、EGFR和p-AKT表達的相關性分析(n=120)

宮頸鱗狀細胞癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，組織學上為高分化、中分化、低分化，高發(fā)年齡為55歲左右，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。本研究顯示在宮頸鱗狀細胞癌組織中，MUC4、EGFR和p-AKT表達陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結的轉移而顯著增高(P<0.05)。MUC4包括2個EGF樣結構域、1個跨膜區(qū)及1個磷酸化位點，MUC4高表達與結腸癌、膽管細胞癌、胰腺癌患者的預后呈負相關[19]。EGFR是生長因子受體，主要參與腫瘤細胞的增殖，目前已經作為一些惡性腫瘤的診斷指標應用于臨床[20]。EGFR表達增加與宮頸癌的惡性度及不良預后相關，EGFR中強表達與臨床分期、腫瘤體積、淋巴結轉移等臨床病理因素相關。宮頸癌中p-AKT受到多種信號分子的影響，與酪氨酸激酶受體如EGFR、FGFR、PDGFR等結合后通過PI3K/AKT信號通路激活細胞的生長和存活[21]。本研究Spearman等級相關分析顯示宮頸鱗狀細胞癌組織的MUC4與EGFR、p-AKT呈顯著正相關性(P<0.05)，EGFR與p-AKT呈顯著正相關性(P<0.05)。有研究顯示在宮頸鱗狀細胞癌中存在EGFR/PI3K/AKT信號通路的激活，可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中PI3K/AKT信號通路主要參與調控細胞的存活[22]。MUC4可以調控EGFR的表達，從而促進腫瘤細胞的轉移和侵襲能力。EGF和TGF-α可以與胞內酪氨酸激酶受體結合后激活其下游的信號通路，從而促進MUC4的轉錄[23]。不過本研究也有一定的不足，與樣本量偏小有關，而且免疫組織化學染色主要是在蛋白水平檢測，可能存在一定的檢測誤差，將在下一步中完善分析。

綜上所述，MUC4、EGFR和p-AKT在宮頸鱗狀細胞癌中呈現高表達，與臨床病理特征參數密切相關，共同參與調節(jié)宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生與發(fā)展。