何 玲 曹愛玲 舒誠榮 周 劍 章 永

目前胃癌的發(fā)生機(jī)制尚未明確，普遍認(rèn)為與年齡、生活習(xí)慣、體內(nèi)激素的變化、生育、血型、環(huán)境等因素有關(guān)[1-4]。由于胃部早期癌變不易診斷且胃癌生長快、轉(zhuǎn)移早，多數(shù)患者就診時(shí)病灶已擴(kuò)散，預(yù)后較差，其5年生存率低，因此深入探討胃癌的發(fā)病機(jī)制對胃癌患者的早期診斷、治療以及提高胃癌患者的生存質(zhì)量具有重要的意義。磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK-1)是單體多肽酶，由包含N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端的PH結(jié)構(gòu)域的556個(gè)氨基酸組成，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡也有著密切的聯(lián)系[5]。PDK-1通過其獨(dú)有產(chǎn)物3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)與細(xì)胞內(nèi)PKB結(jié)合,激活相鄰的PKB分子，進(jìn)而激活靶miRNA 3'-UTR區(qū)域，對下游腫瘤靶基因產(chǎn)生調(diào)控[6-8]。目前關(guān)于PDK-1表達(dá)與胃癌關(guān)系的研究較少，因此本研究擬探討PDK-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2012年1月至2015年4月在我院普外科行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者80例，其中男性41例、女性39例，年齡為47～68歲，平均(57.5±10.8)歲,病程為6個(gè)月～11年， 病變位置：胃體23例，胃竇38例，胃體和胃竇19例。胃鏡下初次評分為29.31～34.28，平均(32.11±1.89)；患者腸化生輕度42例、中度21例、重度17例，異型增生輕度35例、中度30例、重度15例。符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公 布 的 2013 版《Gastric Cancer,Version 2.2013》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。手術(shù)切除標(biāo)本后行病理檢查以判定病理分型、腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、有無淋巴血管間隙浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時(shí)取距胃癌組織5 cm以上的正常胃黏膜為癌旁組?；颊咦栽柑峁┱Ｎ葛つぜ拔赴┙M織標(biāo)本，用作分析PDK-1蛋白的表達(dá)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：既往無精神障礙史，無心理疾患或精神疾病史；本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：冠心病以外的其他心臟病、心功能不全，合并未控制的嚴(yán)重高血壓、瓣膜性心臟病以及急診冠狀動(dòng)脈介入治療者；肝、腎、心功能異常者,感染性疾病、甲狀腺疾病、其他惡性腫瘤、膽汁淤積、自身免疫性疾??；嚴(yán)重高血壓、呼吸道疾病、周圍血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.2 主要儀器和試劑

超凈工作臺(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)、PDK-1 Elisa試劑盒(購于武漢華美生物科技有限公司)、熱電MK3酶標(biāo)儀。

1.3 ELISA測定PDK-1蛋白水平

所有實(shí)驗(yàn)操作均為無菌操作，實(shí)驗(yàn)所有器具高壓滅菌，37 ℃烘干。將保存在-70 ℃冰箱中的正常胃黏膜、胃癌組織取出解凍。稱取0.5 g正常胃黏膜、胃癌組織，加入少量液氮，在微波碾磨儀(5 000 r/s)中迅速將其碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入1 ml Eppendorf管中，加入0.8 ml PBS(pH7.4)，充分振蕩混勻，2 000 g，4 ℃，離心20 min。仔細(xì)收集上清液。獲取正常胃黏膜、胃癌組織勻漿后，采用Elisa法檢測正常胃黏膜、胃癌組織的PDK-1蛋白表達(dá)量。

1.4 PDK-1在正常胃黏膜、胃癌組織中的表達(dá)水平的測定

免疫組化法測定PDK-1在正常胃黏膜、胃癌組織中的表達(dá)，制作常規(guī)5 μm的正常胃黏膜、胃癌組織石蠟切片，3%的H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%的PDK-1抗體工作液(購于英國Abcam公司)，4 ℃過夜，加入二抗(IgG)，室溫30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時(shí)計(jì)數(shù)；>50% 為(+++)，>25%～50% 為 (++)，>5%～25% 為 (+)，陽性細(xì)胞≤5% 為 (-)，(-)及(+)歸為不表達(dá)組或低表達(dá)組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達(dá)組即為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌旁組、胃癌組中PDK-1蛋白水平的表達(dá)

胃癌組PDK-1蛋白表達(dá)水平為(63.63±5.18)ng/g，高于癌旁組的(12.48±4.18)ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=68.733，P<0.01)。

2.2 癌旁組、胃癌組中PDK-1表達(dá)的相關(guān)性分析

胃癌組PDK-1陽性率為75.0%(60/80),高于癌旁組的2.0%(4/80)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=81.667，P<0.01)。

2.3 PDK-1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

PDK-1蛋白表達(dá)與胃癌患者年齡相關(guān)性不明顯(χ2=0.752，P>0.05);與胃癌的病理分型、腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯。鱗癌、腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，PDK-1蛋白陽性表達(dá)率越高(χ2=34.504、4.969、11.709、15.038、8.130、6.771、7.326、8.252，P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.4 PDK-1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后分析

圖1可見，PDK-1 陰性組3年生存率[90.0% Vs 53.3%]及生存期[39.7(30.3～48.2)月]Vs [23.3(18.7～29.8)月]均明顯高于PDK-1 陽性組(χ2=8.604、Z=15.908，P<0.05或P<0.01)。

表1 PDK-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

2014年，全球胃癌患者占所有惡性腫瘤患者的17%，2015年高達(dá)31%[10]。國際癌癥研究中心報(bào)道指出，全世界每年有160萬新增胃癌患者，其死亡率為31.08/10萬，占惡性腫瘤死亡病例的17.98%，2012年全球胃癌新發(fā)病例超過120萬，標(biāo)化發(fā)病率為41.09/10萬，標(biāo)化死亡率為17.54/10萬[11-12]。

PDK-1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色[13]。PDK-1通過激活A(yù)GC激酶家族，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，PI3K/PKB 信號通路就是經(jīng)典的調(diào)控通路。PDK-1在體外含PIP3/PIP2的脂質(zhì)載體環(huán)境中能磷酸化激活PKB或者PKB，若藥物沉默PDK-1蛋白表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的生長得到有效抑制，其機(jī)制可能與PIP3單獨(dú)與PKB結(jié)合時(shí)，不能激活PKB有關(guān)，這也說明PDK-1蛋白可能成為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[14]。研究表明PDK-1對促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，并能強(qiáng)烈抑制細(xì)胞凋亡，高度表達(dá)PDK-1的乳腺癌細(xì)胞株增殖能力高于野生株。高表達(dá)PDK-1蛋白的腫瘤細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的能力強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合才能穿過細(xì)胞外基質(zhì)層,建立轉(zhuǎn)移灶[15]。本研究中，胃癌組PDK-1水平明顯高于癌旁組，且胃癌組PDK-1陽性率高于癌旁組，這與上述結(jié)論一致。

研究已證實(shí)，PDK-1在人胚胎組織中廣泛表達(dá)，在正常的甲狀腺表達(dá)正常，甲狀腺癌患者PDK-1蛋白表達(dá)異常增高，而隨著甲狀腺癌患者TMN分期的進(jìn)展，PDK-1表達(dá)逐漸升高[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，病理學(xué)分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，胃癌組織中 PDK-1表達(dá)越高。這與上述結(jié)論一致。PDK-1在Hedgehog 信號通路扮演著核心調(diào)節(jié)作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結(jié)合時(shí)，Ptch 激活跨膜蛋白受體(Smo)的活化，進(jìn)而Hedgehog 信號通路活化，當(dāng)Shh和Ptch結(jié)合時(shí)，解除了Ptch對Smo的抑制作用，Smo被釋放，進(jìn)而活化下游轉(zhuǎn)錄因子PDK-1，促進(jìn)PDK-1移位到細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致 Hedgehog 信號通路活化，而PDK-1能激活WNT信號通路，將細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，與TCF/LEF的同源異構(gòu)區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致靶基因過度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制失衡，細(xì)胞大量增殖，發(fā)生癌變，形成惡性表型。本研究中，PDK-1的高表達(dá)與病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴血管間隙浸、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的正相關(guān)關(guān)系，這也與上述PDK-1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移機(jī)制相符合。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中一些血管活性因子(MCP-1、TNF-a、IL-1、IL-8)與PDK-1表達(dá)正相關(guān)。IL-8、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可能由PDK-1調(diào)控，高表達(dá)PDK-1的腫瘤細(xì)胞可促進(jìn)IL-8、VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在供應(yīng)腫瘤生長及實(shí)體腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究預(yù)后分析也顯示，PDK-1 陰性組3年生存率及生存期均明顯高于PDK-1 陽性組，這說明PDK-1具有促進(jìn)癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用，PDK-1高表達(dá)能明顯降低胃癌患者預(yù)后。

綜上所述，PDK-1蛋白在胃癌組織中表達(dá)量增加，PDK-1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用；PDK-1蛋白低表達(dá)的胃癌患者能獲得較好的預(yù)后。