張紅兵，鄭 博，楊曉崗，馬廣強(qiáng)

作者單位:1(710002)中國(guó)陜西省西安市第一醫(yī)院眼科 陜西省眼科研究所;2(330004)中國(guó)江西省南昌市，江西中醫(yī)藥大學(xué)

0 引言

自從 1994年 Smith等［1］將早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)小鼠動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)化以來(lái)，涌現(xiàn)出了許多以該模型為載體的ROP相關(guān)基礎(chǔ)研究，為深入認(rèn)識(shí)和更好防治ROP起了很大推動(dòng)作用［2－5］。在制作ROP小鼠模型時(shí)，如何保持新生小鼠穩(wěn)定持續(xù)暴露在75%±2%的氧濃度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中自行研制了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的氧濃度可控制小鼠飼養(yǎng)箱(專利號(hào):ZL 2010 2 0647695.X.)，效果顯著，性能穩(wěn)定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

圖1 氧濃度可控制小鼠飼養(yǎng)箱模式圖。

圖2 氧濃度可控制小鼠飼養(yǎng)箱內(nèi)面觀。

1.1 材料 數(shù)字顯示控氧儀(KY－2F型，常州恒隆儀器有限公司)、電磁閥(2W－025－08，中國(guó)德力西控股集團(tuán)有限公司)、有機(jī)玻璃(5mm，西安久力恒亞克力制品有限公司)、有機(jī)玻璃粘合劑(三氯甲烷，湖南恒隆石油化工有限公司)、氧氣減壓器(YQY－342，上海減壓器廠)。

1.2 方法 (1)用玻璃膠粘合制作有機(jī)玻璃飼養(yǎng)箱，正面開(kāi)口，供飼養(yǎng)小鼠的籠子出入，開(kāi)口的周?chē)徯D(zhuǎn)螺絲孔，便于固定封口的密封蓋，側(cè)面有通風(fēng)口，通風(fēng)口處安裝一個(gè)閥門(mén)，控制通風(fēng)口大小，平衡飼養(yǎng)箱內(nèi)外壓力。(2)從頂部向飼養(yǎng)箱內(nèi)接入KY－2F型數(shù)字顯示控氧儀的氧氣探頭和輸送氧氣的送氣管，送氣管由電磁閥控制。(3)連接測(cè)氧儀和電磁閥。(4)通過(guò)測(cè)氧儀上的參數(shù)設(shè)置按鈕，設(shè)定測(cè)氧儀正常范圍為74%～76%，當(dāng)氧分壓低于74%時(shí)，測(cè)氧儀發(fā)出指令，報(bào)警器發(fā)出報(bào)警聲，同時(shí)電磁閥開(kāi)放，開(kāi)始向飼養(yǎng)箱里輸入氧氣，當(dāng)氧分壓高于76%時(shí)，測(cè)氧儀發(fā)出指令，報(bào)警器發(fā)出報(bào)警聲，同時(shí)電磁閥關(guān)閉，停止輸入氧氣，最終維持氧分壓在 74%～76%(圖 1、2)。

1.2.1 鑒定方法 將出生第7d C57BL/6J小鼠連同母鼠以窩為單位分成兩組，每組6只，一組在正常環(huán)境中飼養(yǎng)10d，另一組放于高氧箱內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)5d，再在正常環(huán)境中飼養(yǎng)5d。第17d每組3只新生小鼠用氯胺酮(60mg/kg，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)和賽拉嗪(18mg/kg，吉林省方正動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司)麻醉新生小鼠，剪開(kāi)左側(cè)肋骨，暴露心臟，向左心室內(nèi)注射熒光素標(biāo)記的高分子量右旋糖酐(50mg/mL，Sigma)，解剖出眼球，避光在4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)固定24h后解剖出視網(wǎng)膜，平鋪固定在載玻片上，熒光顯微鏡觀察照相。第17d每組另外3只新生小鼠視網(wǎng)膜做HE染色，具體方法為新生小鼠麻醉后解剖出眼球(不暴露心臟)，4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)固定24h后，石蠟包埋切片，HE染色觀察玻璃體腔視網(wǎng)膜新生血管生成情況。

圖3 視網(wǎng)膜分區(qū)模式圖(相鄰分區(qū)線的距離相同)。

圖4 正常新生小鼠第17d視網(wǎng)膜鋪片(結(jié)合熒光素的高分子量右旋糖酐心臟灌注):視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)和新生血管生成(×4)。

圖5 高氧條件下第17d新生小鼠視網(wǎng)膜鋪片(結(jié)合熒光素的高分子量右旋糖酐心臟灌注):視網(wǎng)膜血管大片無(wú)灌注區(qū)和新生血管生成(×4)。

1.2.2 視網(wǎng)膜新生血管量化 在高氧條件下，未發(fā)育成熟的新生小鼠視網(wǎng)膜，在血管化過(guò)程中生成了病理性新生血管、新生血管芽和新生血管突［6－8］。盡管這些新生血管芽和新生血管突可能分布不一致，但是如果將視網(wǎng)膜用不同半徑的同心圓分成四個(gè)區(qū)(以視盤(pán)為中心，分別以視盤(pán)到視網(wǎng)膜邊緣距離的1/4、2/4、3/4和4/4為半徑畫(huà)圓，將視網(wǎng)膜分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)區(qū))，通過(guò)計(jì)數(shù)不同區(qū)的新生血管芽和新生血管突，可以反映氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度［9］(圖 3)。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜鋪片 第17d正常環(huán)境中飼養(yǎng)的3只C57BL/6J新生小鼠視網(wǎng)膜大血管走形正常，無(wú)迂曲擴(kuò)張，小血管分布均勻，無(wú)無(wú)灌注區(qū)和新生血管生成，而高氧組3只C57BL/6J新生小鼠視網(wǎng)膜大血管迂曲擴(kuò)張，小血管分布不均勻，后極部視網(wǎng)膜大片無(wú)灌注區(qū)形成，周?chē)罅啃律苌?圖 4、5)。

圖6 視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)與全部視網(wǎng)膜面積的比值:正常氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜無(wú)無(wú)灌注區(qū)形成，而高氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)面積為33.07%。

圖7 視網(wǎng)膜新生血管突在視網(wǎng)膜不同區(qū)域的分布:正常氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜沒(méi)有新生血管突生成，而高氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜大量新生血管突生成，且主要位于II和III區(qū)。

圖8 視網(wǎng)膜新生血管叢在視網(wǎng)膜不同區(qū)域的分布:正常氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜沒(méi)有新生血管叢生成，而高氧條件下新生小鼠視網(wǎng)膜大量新生血管叢生成，且主要位于II和III區(qū)。

2.2 視網(wǎng)膜新生血管量化分析 正常C57BL/6J新生小鼠在第17d已經(jīng)完成視網(wǎng)膜血管化，無(wú)無(wú)灌注區(qū)、視網(wǎng)膜新生血管突和新生血管叢生成，而經(jīng)過(guò)高氧環(huán)境誘導(dǎo)的C57BL/6J新生小鼠，第17d視網(wǎng)膜中央大片無(wú)灌注區(qū)生成(33.07%)，并有新生血管突和新生血管叢生成，且主要聚集在Ⅱ區(qū)(40.27%)和Ⅲ區(qū)(44.97%)，而Ⅰ區(qū)(4.36%)和Ⅳ區(qū)(10.40%)較少(圖6～8)。

2.3 視網(wǎng)膜切片比較 正常環(huán)境中飼養(yǎng)的3只C57BL/6J新生小鼠，第17d視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)規(guī)整，內(nèi)界膜完整，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層為單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核組成，血管結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，但是少且排列整齊(圖9);飼養(yǎng)箱內(nèi)高氧誘導(dǎo)的C57BL/6J新生小鼠，第17d視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)界膜不完整，為長(zhǎng)入的新生血管破壞，部分增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入玻璃體腔，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，由于血管內(nèi)皮等細(xì)胞的增生，單層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變?yōu)槎鄬?，并且排列不?guī)則(圖10)。

3 討論

圖9 正常新生小鼠第17d視網(wǎng)膜HE染色:視網(wǎng)膜內(nèi)界膜完整，沒(méi)有新生血管長(zhǎng)入(×100)。

圖10 高氧誘導(dǎo)后第17d新生小鼠視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜不規(guī)整，新生血管突視網(wǎng)膜內(nèi)界膜規(guī)整，無(wú)新生血管突破(HE染色×100)。

目前國(guó)內(nèi)從事ROP基礎(chǔ)研究很多，制作該動(dòng)物模型時(shí)建立高氧環(huán)境常有以下幾種方法:(1)給小鼠飼養(yǎng)箱內(nèi)間斷人工充氧，用測(cè)氧儀間斷測(cè)定飼養(yǎng)箱內(nèi)氧濃度;(2)用高壓氧艙飼養(yǎng)小鼠;(3)購(gòu)置進(jìn)口控氧儀(PRO－OX 110 chamber oxygen controller，Biospherix Ltd，Redfield，NY)。這些方法存在很多現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，測(cè)氧儀間斷測(cè)量飼養(yǎng)箱內(nèi)氧濃度，很難保持飼養(yǎng)箱內(nèi)氧濃度穩(wěn)定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性;進(jìn)口控氧儀控氧性好，但是價(jià)格昂貴，一般研究人員很難有充足的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)購(gòu)買(mǎi)這種設(shè)備;高壓氧艙控氧效果理想，但是專門(mén)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)購(gòu)買(mǎi)這種昂貴儀器的可能性更小，同時(shí)維持儀器正常運(yùn)轉(zhuǎn)的費(fèi)用高昂，專門(mén)借用可能性也不大。基于上述原因，研制氧濃度可控性好、價(jià)格實(shí)惠的小鼠飼養(yǎng)箱，對(duì)成功制作ROP動(dòng)物模型具有明顯實(shí)用價(jià)值。

KY－2F數(shù)字顯示控氧儀由氧電極、放大器、模擬比較器和報(bào)警器四部分組成，其中氧電極以鉑金為陰極，氯化銀為陽(yáng)極，并以聚四氟乙烯為滲透隔離膜，氣體中的氧氣可以透過(guò)薄膜到達(dá)陰極，在650mV的極化電壓下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并快速達(dá)到平衡，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)極限擴(kuò)散電流，此電流大小與氣體中的氧分壓成正比，因此可以感受周?chē)h(huán)境中的氧分壓變化。產(chǎn)生的電流一部分通過(guò)顯示屏，顯示所測(cè)氣體的氧氣含量，另一部分通過(guò)模擬比較器推動(dòng)繼電器，當(dāng)氧氣含量超過(guò)設(shè)定值時(shí)儀器發(fā)出聲光報(bào)警，同時(shí)向電磁閥輸出電流。

電磁閥是利用電磁感應(yīng)原理，控制閥門(mén)開(kāi)啟或關(guān)閉的自動(dòng)化基礎(chǔ)元件，在本研究中，它可以調(diào)整氧氣瓶向飼養(yǎng)箱里輸送氧氣的流量和速度，當(dāng)數(shù)字控氧儀產(chǎn)生的電流流入電磁閥里面的線圈時(shí)，由于電磁感應(yīng)產(chǎn)生電磁力，當(dāng)電磁力大于電磁閥里彈簧對(duì)動(dòng)鐵芯的阻力時(shí)，動(dòng)鐵芯克服彈力，和靜鐵芯直接吸和，閥門(mén)被打開(kāi)，氧氣進(jìn)入氧箱，當(dāng)數(shù)字控氧儀沒(méi)有電流流入電磁閥線圈時(shí)，線圈不能產(chǎn)生電磁力，動(dòng)鐵芯在彈簧的彈力作用下離開(kāi)靜鐵芯，閥門(mén)關(guān)閉，氧氣不再進(jìn)入飼養(yǎng)箱。

有機(jī)玻璃飼養(yǎng)箱是根據(jù)有機(jī)玻璃對(duì)氣體壓力耐受程度和便于觀察而采用的，并參考小鼠飼養(yǎng)籠的尺寸設(shè)計(jì)飼養(yǎng)箱的體積、出入口和通風(fēng)口，最后用有機(jī)玻璃膠粘合而成。有機(jī)玻璃飼養(yǎng)箱接口密封處無(wú)氧氣漏出，側(cè)面透氣孔可以有效平衡飼養(yǎng)箱內(nèi)外壓力，避免飼養(yǎng)箱因箱內(nèi)壓力過(guò)高而爆裂，頂部接入的控氧儀探頭可以靈敏及時(shí)的感知飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓，并通過(guò)報(bào)警器上的顯示器顯示出來(lái)，同時(shí)控氧儀還可以通過(guò)電磁閥，及時(shí)調(diào)控氧氣管的開(kāi)放和閉合，最終使飼養(yǎng)箱內(nèi)氧濃度穩(wěn)定在設(shè)定范圍。

KY－2F數(shù)字顯示控氧儀、電磁閥和有機(jī)玻璃的合理組合，得到氧氣濃度可以控制的小鼠飼養(yǎng)箱，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)氧儀的比較，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)箱上的測(cè)氧儀可以準(zhǔn)確測(cè)量飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓，并及時(shí)將電信號(hào)發(fā)送給報(bào)警裝置和電磁閥，始終維持飼養(yǎng)箱里氧分壓在需要范圍內(nèi)，為順利進(jìn)行試驗(yàn)、消除誤差和結(jié)果穩(wěn)定奠定了基礎(chǔ)，這也被以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)。

我們應(yīng)用自己設(shè)計(jì)的氧濃度可控制小鼠飼養(yǎng)箱，按照文獻(xiàn)建議的方法［1，9］，6只在氧箱內(nèi)飼養(yǎng)的 C57BL/6J新生小鼠，第17d視網(wǎng)膜全部誘導(dǎo)出了新生血管(3只新生小鼠視網(wǎng)膜做HE染色，3只新生小鼠視網(wǎng)膜做鋪片)，而在正常環(huán)境中飼養(yǎng)的新生小鼠第17d視網(wǎng)膜完全血管化，并且沒(méi)有新生血管生成，并已有相關(guān)論文發(fā)表［10－12］。

總之，該裝置設(shè)計(jì)合理，控制飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓快速準(zhǔn)確，相關(guān)部件全部國(guó)產(chǎn)，價(jià)格不貴，維修方便，既解決了間斷測(cè)氧的繁瑣和不能維持飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓始終在75%左右的缺點(diǎn)，又避免了購(gòu)買(mǎi)高壓氧艙和早產(chǎn)兒暖箱的高昂費(fèi)用，既滿足了本研究需要，又可在其它相關(guān)研究使用，具有一定推廣價(jià)值。