李 桐，付連雙，劉 鑫，李卓夫，秦 鵬，張占國，王曉楠

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

黑龍江位于中國的最北部，其氣候寒冷，冬季最低氣溫能夠達(dá)到-30 ℃，因此只有抗寒性極強(qiáng)的冬小麥品種才能在此地安全越冬[18]?？购澡b定包括越冬后田間調(diào)查成活率、室內(nèi)低溫處理及生理指標(biāo)間接鑒定[19-20]。田間調(diào)查成活率所需的時(shí)間較長且受不同年份間氣候不穩(wěn)定的影響，有時(shí)不能真實(shí)反映品種的抗寒性，因此室內(nèi)低溫處理結(jié)合生理生化指標(biāo)或分子輔助育種手段常用于小麥抗寒性快速鑒定[21-22]。如趙瑞玲[23]對(duì)209份小麥材料給予在-8～-16 ℃范圍連續(xù)的降溫處理，每2 ℃為一個(gè)梯度，每個(gè)溫度作用3 h，低溫處理后調(diào)查成活率，鑒定出8份抗寒材料。張淑霞等[24]室內(nèi)模擬田間0～-32 ℃低溫，每隔2 ℃為一個(gè)梯度，低溫處理后恢復(fù)溫度，然后調(diào)查成活率，Logistic方程擬合返青成活率曲線。前人關(guān)于室內(nèi)低溫處理方式的研究多為梯度緩慢降溫，關(guān)于連續(xù)低溫對(duì)植株的影響研究尚未見報(bào)道。本研究以抗寒性不同的小麥品種為材料，設(shè)置室內(nèi)快速低溫、緩慢低溫和大田種植三種溫度處理，檢測(cè)SOD、POD、CAT、APX活性及ASA、GSH、MDA和H2O2含量等生理指標(biāo)，分析兩種室內(nèi)低溫處理與大田種植間生理指標(biāo)的相關(guān)性及差異，以期明確適合室內(nèi)抗寒性檢測(cè)的低溫處理方式及生理指標(biāo)，為室內(nèi)快速鑒定冬小麥的抗寒性提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取冬小麥抗寒品種東農(nóng)冬麥1號(hào)(由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種所培育，越冬返青率高于80%)、弱抗寒品種濟(jì)麥22(由山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育，在黑龍江地區(qū)種植越冬返青率低于30%)和不抗寒品種中國春(在黑龍江冬季不能越冬，返青率為0%)為供試材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

大田種植：2015年9月1日種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)地，田間隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小麥行長5 m，行距30 cm，10行區(qū)，種植密度均為200萬株·hm-2。分別在2015年10月15日、10月30日、11月15日(開始進(jìn)入封凍期)、11月30日、12月15日、12月30日和2016年1月15日取樣，每次取樣每個(gè)品種隨機(jī)取30株。

室內(nèi)低溫處理：在長40 cm、寬30 cm的白色塑料盆中，每盆40粒種子，放置于光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為2 000 lx，25 ℃ 16 h光照/18 ℃ 8 h黑暗，生長至3葉1心期時(shí)進(jìn)行冷馴化處理。冷馴化期間植株生長環(huán)境設(shè)置：光照強(qiáng)度為2 000 lx，10 ℃ 16 h光照/4 ℃ 8 h黑暗。冷馴化30 d后將盆栽轉(zhuǎn)移至-40 ℃美菱低溫冰箱進(jìn)行冷凍處理?？焖俚蜏睾途徛蜏靥幚砹杏诒?，取樣部位是包含生長點(diǎn)的分蘗節(jié)，每次取樣30株清洗干凈后置于-80 ℃保存。

1.3 測(cè)定方法

MDA含量測(cè)定參照李合生[25]的方法；H2O2含量、APX活性測(cè)定參照鄒 琦[26]的方法；SOD、 POD、CAT活性測(cè)定參考陳建勛[27]的方法；ASA含量測(cè)定參照KAMPFENKEL[28]的方法；GSH含量測(cè)定參照MA[29]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS 7.05分析差異顯著性及相關(guān)性，用R語言計(jì)算歐式距離，用EXCEL制作圖。

表1 室內(nèi)低溫處理方式Table 1 Indoor low temperature treatment

圖1 田間取樣溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫下小麥植株的MDA及H2O2含量變化

大田條件下小麥的MDA含量隨時(shí)間推移呈先升后降再升的變化趨勢(shì)。3個(gè)品種均在11月30日達(dá)到第一個(gè)峰值，此時(shí)中國春(CS)、濟(jì)麥22(JM22)和東農(nóng)冬麥1號(hào)(DM1)的MDA含量分別為30.11、26.38和33.11 μmol·g-1，但至1月15日，抗寒性最弱的CS的MDA含量達(dá)到了32.96 μmol·g-1，而抗寒品種DM1僅為12.64 μmol·g-1(圖1)。大田條件下小麥的H2O2含量隨著時(shí)間推移呈逐漸增高趨勢(shì)。10月15日3個(gè)品種間差異不顯著，但之后CS的H2O2含量增加較快，而JM22和DM1增加較慢，至1月15日CS、JM22和DM1的H2O2含量分別為 12.33、11.34和8.97 μmol·g-1FW。

與室內(nèi)緩慢低溫處理相比，室內(nèi)快速低溫處理下，小麥的MDA和H2O2含量均較高，差異均顯著(圖1)。品種間無論室內(nèi)快速低溫處理還是緩慢低溫處理，MDA和H2O2含量均表現(xiàn)為CS>JM22>DM1。

2.2 低溫下小麥的活性氧清除酶活性及抗氧化劑含量的變化

大田條件下，3個(gè)小麥品種的SOD活性呈先升再降的變化趨勢(shì)，說明小麥為應(yīng)對(duì)低溫在脅迫初期會(huì)增加SOD活性。封凍期后3個(gè)品種的SOD活性逐漸降低，至1月15日CS、JM22和DM1的SOD活性分別為35.97、55.29 和74.98 U·g-1·min-1。田間的POD活性變化趨勢(shì)與SOD活性相似，也表現(xiàn)為先升再降的變化趨勢(shì)。CS、JM22和DM1的POD活性均在11月30日達(dá)到最高值，分別為4 044、4 336和4 578 U·g-1·min-1，至1月15日POD活性則分別1 399、2 556和4 039 U·g-1·min-1。

室內(nèi)-14、-16和-18 ℃低溫處理時(shí)，SOD活性均表現(xiàn)為緩慢低溫處理顯著高于快速低溫處理，品種間表現(xiàn)為JM22>DM1>CS；而POD活性表現(xiàn)為緩慢低溫處理顯著低于快速低溫處理，品種間表現(xiàn)為DM1>JM22>CS。

3種低溫處理下田間種植的CAT活性最低。CS、JM22和DM1的田間CAT活性均在11月30日達(dá)到最高值，分別為1 368、1 412和2 161 U·g-1FW·min-1，至封凍期1月15日分別下降為451、449和1 042 U·g-1FW·min-1。CS、JM22和DM1的田間APX含量分別在10月30日、11月30日和11月30日達(dá)到最高值，分別為6.47、6.23和10.65 U·g-1FW·min-1，至1月15日CS與JM22差異不明顯，但顯著低于DM1。田間種植的GSH含量顯著高于室內(nèi)低溫處理，CS、JM22和DM1的GSH含量變化范圍分別為0.62～3.79、3.15～6.13和3.15～6.54 μg·g-1FW，至1月15日3個(gè)品種的GSH含量分別為3.78、5.12和5.84 μg·g-1FW。田間種植的ASA含量呈波動(dòng)式變化，CS、JM22和DM1的ASA含量均在11月15日均達(dá)到最高值，分別為8 676、12 606和17 745 μg·g-1FW。

SK:室內(nèi)快速低溫；SM:室內(nèi)緩慢低溫；DT:田間種植。 CS：中國春；JM22：濟(jì)麥22；DM1：東農(nóng)冬麥1號(hào)。圖柱上的不同字母表示相同品種的不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖例的括號(hào)內(nèi)外數(shù)值分別為室內(nèi)外溫度。圖3同。

SK:indoor rapid low temperature; SM:indoor slow low temperature; DT:field planting. CS:China Spring; J22:Jimai 22; D1:DongnongDongmai 1.Different letters indicate significant difference among the treatments for a same variety at 0.05 level.The values out and in the brackets are the indoor and outdoor temperatures, respectively. The same in figure 3.

圖2 三種低溫處理下品種間MDA和H2O2含量的比較分析

Fig.2 Comparative analysis of MDA and H2O2contents among three varieties under low temperature treatments

圖3 三種低溫處理下品種間活性氧清除物質(zhì)的含量或活性差異

室內(nèi)緩慢低溫處理下CS的CAT活性高于室內(nèi)快速低溫處理，而JM22和DM1表現(xiàn)為室內(nèi)快速低溫處理高于室內(nèi)緩慢低溫處理；室內(nèi)低溫處理下DM1的APX活性顯著高于其他品種， -18 ℃緩慢低溫和快速低溫處理下CS和JM22間APX活性差異不顯著，但顯著低于DM1；室內(nèi)-14、-16、-18 ℃緩慢低溫和快速低溫處理下ASA和GSH含量均呈DM1>JM22>CS。

2.3 室內(nèi)兩種降溫處理方式與大田種植的相關(guān)性

相關(guān)分析(表1)表明，室內(nèi)快速低溫處理的SOD、CAT活性及MDA、H2O2、ASA含量與大田條件下的測(cè)定值均呈極顯著正相關(guān)，而室內(nèi)緩慢低溫處理的H2O2含量及POD、CAT活性與大田條件下的測(cè)定值均顯著或極顯著正相關(guān)。從不同處理間的數(shù)據(jù)歐氏距離(表3)看，除POD活性外，其余指標(biāo)均表現(xiàn)為室內(nèi)快速低溫處理與大田種植間的差異小于室內(nèi)緩慢處理與大田種植間的差異，說明室內(nèi)快速低溫處理與大田種植的數(shù)據(jù)更為接近。

對(duì)所有處理下的小麥不同指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)分析(表3)表明，MDA含量與GSH含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與H2O2含量呈顯著正相關(guān)。H2O2含量與ASA含量和SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表2 室內(nèi)低溫處理的生理指標(biāo)與大田種植的生理指標(biāo)相關(guān)性Table 2 Correlation between indoor low temperature treatments and field physiological indices

*：P<0.05;**：P<0.01.

表3 室內(nèi)低溫處理各生理指標(biāo)與大田種植生理指標(biāo)的歐氏距離Table 3 Euclidean distance between indoor low temperature treatments and field physiological indices

表4 小麥不同生理指標(biāo)間相關(guān)性Table 4 Correlation among different physiological indices of wheat

*：P<0.05;**：P<0.01.

3 討 論

本研究中，低溫下三個(gè)小麥品種的MDA含量增加，這與前人的研究基本一致[30]。低溫下冬性、春性小麥的MDA含量差異顯著。Zhang[31]研究得出，低溫下冬小麥品種京河1號(hào)、蘇引10號(hào)的MDA含量均低于弱抗寒的小麥魯麥22號(hào)和春小麥晉春9號(hào)，其中春小麥晉春9號(hào)的MDA含量最高。本研究中，東農(nóng)冬麥1號(hào)(冬性)<濟(jì)麥22(弱冬性)<中國春(春性)。室內(nèi)快速冷凍低溫處理的MDA含量要顯著高于室內(nèi)緩慢低溫處理的MDA含量，大田條件下只有在12月30日和1月15日中國春的MDA含量接近室內(nèi)低溫處理，而東農(nóng)冬麥1號(hào)和濟(jì)麥22的MDA含量要顯著低于室內(nèi)低溫處理，說明室內(nèi)低溫處理的小麥膜脂過氧化程度較封凍后大田種植嚴(yán)重。