吳 寬，牛永浩，康克功，趙 磊，吳云鋒

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學院生物工程分院，陜西楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學植保學院，陜西楊凌 712100)

小麥是全世界最主要的糧食作物之一，在我國的種植面積居全球首位[1]。小麥黃矮病由大麥黃矮病毒(BYDV)與禾谷類黃矮病毒(CYDV)侵染引起，在世界范圍影響小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。我國小麥黃矮病主要由BYDV危害引起。由于目前生產(chǎn)上缺乏優(yōu)質(zhì)抗病毒品種，防治該病的主要措施是噴施抗病毒劑和殺蟲劑，通過控制病毒初侵染源和傳毒介體蚜蟲控制病害流行爆發(fā)[3]。為了持久控制該病害，培育和種植抗病品種是最經(jīng)濟有效的方法。大量研究表明，常規(guī)小麥品種一般不抗黃矮病。迄今為止，抗黃矮病的材料僅有中4、中5等[4]。本研究團隊發(fā)現(xiàn)，華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica)高抗黃矮病毒BYDV-GAV[5]。目前，對各種華山新麥草易位系的抗病性水平缺乏系統(tǒng)研究。為了明確各種華山新麥草易位系抗病性水平并在今后抗病育種中加以利用，本試驗采用堆測法種植易位系材料，苗期接種飼毒蚜蟲以傳毒，對27份華山新麥草易位系材料進行抗病性鑒定，并運用RT-PCT技術(shù)半定量各種易位系植株體內(nèi)病毒含量，為給優(yōu)質(zhì)抗BYDV新品種的選育提供重要種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為華山新麥草易位系27份，抗病小麥品種中5、感病小麥品種7182分別作為對照。BYDV-GAV、介體麥二叉蚜(Schizaphisgramimum)、質(zhì)粒載體、菌株、酶等材料來源于西北農(nóng)林科技大學分子植物病毒學實驗室。Marker DL-2000由大連TaKaRa公司生產(chǎn)，凍存于 -80 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 無毒蚜蟲的繁殖與毒源擴繁

介體麥二叉蚜在人工氣候箱中繁殖，培養(yǎng)溫度為22 ℃，光暗周期為14/10 h。毒源BYDV-GAV長期保存在人工氣候箱內(nèi)暗黑燕麥苗上，外罩紗網(wǎng)。毒源擴繁的方法：取3葉期的燕麥5～6盆，接飼毒2 d的帶毒蚜蟲到幼苗上，每株3～5頭，繁殖毒源3 d，培養(yǎng)溫度20 ℃，光暗周期為16/8 h。

1.2.2 材料播種、病毒接種與抗病性調(diào)查

采用堆測法(hill plot technique)[6]進行田間抗病性鑒定，2015-2017年在西北農(nóng)林科技大學農(nóng)一站進行。穴播，每穴點播5粒，每個處理播8穴，分為接種病毒畦和不接種病毒對照畦，重復3次。每年10月8日播種。在當年11月10日和次年返青期4月1日接種帶毒蚜；接種10 d后葉面噴施2.5%高效氯氟氰菊酯水乳劑1 000倍稀釋液滅蚜。接種后1個月調(diào)查發(fā)病株數(shù)與發(fā)病級別、株高、分蘗數(shù)，根據(jù)國際通用的黃矮病0～9級病情分級標準記錄發(fā)病級別與株數(shù)[7]。分別測量每份材料的千粒重，計算千粒重(thousand kernel weight,TKW)的下降率?？共⌒杂貌∏橹笖?shù)來衡量，25以下為抗耐病(R)， 25～50為感病(S)，50以上為高感(HS)[7]。病情指數(shù)=∑(發(fā)病級別×相應各級病株數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×10)×100，千粒重損失率=(未接種對照千粒重-接種千粒重)/未接種對照千粒重×100%。

1.2.3 植物總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增

參照文獻[8-9]提取病葉總 RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA。參考文獻[9]公布的陜西分離物GAV全基因組序列，設(shè)計CP基因特異性引物，正向引物為5′-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGAAAT-3′，反向引物為5′-CTATTTGGGAGTCATGTTGGCAAC-3′，以25.0 μL反應體系進行PCR擴增[10]；用10%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物,觀察照相。GAV CP基因序列送到西安擎科澤西科技有限責任公司進行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的抗病性

應用堆測法田間播種試驗材料，人工接種帶毒蚜蟲，結(jié)果(圖1)表明，感病對照7182全部發(fā)病，病情指數(shù)為54.67；抗病對照中5零星單株表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為0.73；華山新麥草易位系H9020-1-6-8-3等5份材料的病情指數(shù)介于 13.56～18.89，表明其對GAV表現(xiàn)抗性；H924-3-4 等9份材料的病情指數(shù)是介于 27.78～ 48.89，表現(xiàn)為感病；其余H9014-27-1-3-5-5等13份材料的病情指數(shù)均大于50.0，表現(xiàn)高感病性。

2.2 病毒侵染對株高、分蘗的影響

調(diào)查結(jié)果表明，冬前感染病毒的華山新麥草易位系幼苗株高降低率達到33.3%～66.6%，有效分蘗數(shù)減少50%。在拔節(jié)期～抽穗期感染病毒，感病華山新麥草易位系僅在旗葉或上部葉表現(xiàn)葉尖黃化癥狀。運用RT-PCT技術(shù)半定量法檢測植株體內(nèi)病毒含量，結(jié)果顯示，被接種的華山新麥草易位系中均能檢出GAV病毒，抗病毒易位系材料CP條帶暗淡，說明病毒含量較低，而感病材料CP條帶較明亮，說明葉片中病毒含量較高；接種區(qū)材料能檢測到GAV，未接種區(qū)材料沒有檢測到病毒(圖 2)。

圖1 華山新麥草易位系抗黃矮病鑒定

2.3 病毒侵染對千粒重的影響

研究結(jié)果(表1)表明，華山新麥草易位系感染病毒后，造成千粒重不同程度的減少，其中，抗病性水平高的H9015-17-4-4、H9020-17-25-6-4千粒重損失率分別為5.31%、4.13%，高感材料H9014-14-4-6-1、H9014-154-2-15-3千粒重損失率分別為11.57%、11.31%。說明病毒侵染對抗病材料千粒重影響較小，對高感材料影響較大。

3 討 論

小麥黃矮病抗病材料的篩選、鑒定是一項基礎(chǔ)性工作，對抗病育種工作具有重要意義。錢幼亭等[7]、于祥泉等[3]通過對我國小麥品種和農(nóng)家品種鑒定，獲得了一些抗性品種。華山新麥草是我國華山山脈獨有的珍稀物種，屬于我國一級重點保護植物，是小麥近緣野生種質(zhì)資源，具有很強的抗旱性、耐瘠薄、抗條銹病特性[11]。目前，有關(guān)我國通過細胞工程創(chuàng)制的華山新麥草易位系材料抗黃矮病的研究報道較少。本研究采用堆測法首次明確了華山新麥草易位系具有抗病、感病和高感類型，篩選到抗GAV的易位系H9020-1-6-8-3、H9020、H9020-17-3-5-6-4、H9020-20-12-1-8、H9015-17-4-4、H924-3-4。半定量分子檢測結(jié)果顯示，被檢測易位系都受到了黃矮病毒GAV的侵染，但抗病的易位系葉片內(nèi)病毒GAV病毒含量較低，而感病的易位系葉片內(nèi)病毒含量較高。長期以來，除了發(fā)現(xiàn)的中4、中5品種等抗黃矮病外，國內(nèi)外尚未尋找到優(yōu)質(zhì)的抗黃矮病資源[12]。篩選的華山新麥草易位系抗病材料可作為抗病毒種質(zhì)資源在培育抗病毒新品種中加以利用，對該病在黃矮病流行區(qū)的防治將具有重要作用。

M：DM2000；1、7、8、16：未接種病毒的單株，依次為 7182、中5、H902 0-1-6-8-3、H9020-17-25-4-12; 2-6、9-15、17-28：接種病毒的單株，依次為 H9014-14-1-9-2、H9020-17-5、H9021-49-166-1、H921-11-10-10-10、H92-112、H9020-1-6-8-3、H9020、H9020-17-3-5-6-4、H9020-20-12-1-8、H9015-17-4-4、H924-3-4、H9020-17-25-4-12、7182、中5、H924-3-2、H9017-16-5-5、H8、H9020-17-3-5-6、H9、H9014-121-5-5-9、H9014-121-5-8-11、H9014-14-4-6-1、H9014-154-2-15-3、H9014-157-2-15-3。病毒CP基因條帶：600 bp。

M:DM2000; 1,7,8 and 16:Non-inoculated virus plant,7182,Zhong 5,H902 0-1-6-8-3 and H9020-17-25-4-12; 2-6,9-15,and 17-28:Inoculated virus plant,H9014-14-1-9-2,H9020-17-5,H9021-49-166-1,H921-11-10-10-10,H92-112H9020-1-6-8-3,H9020,H9020-17-3-5-6-4,H9020-20-12-1-8,H9015-17-4-4,H924-3-4,H9020-17-25-4-12,7182,Zhong 5,H924-3-2,H9017-16-5-5,H8,H9020-17-3-5-6,H9,H9014-121-5-5-9,H9014-121-5-8-11,H9014-14-4-6-1,H9014-154-2-15-3 and H9014-157-2-15-3。CP gene band:600 bp.

圖2 華山新麥草易位系單株中病毒CP相對含量的RT-PCR檢測

Fig.2 RT-PCR detection of GAV CP inP.huashanicatranslocation lines

表1 病毒感染對千粒重的影響Table 1 Influence of virus infection on TKW

在進行華山新麥草易位系的黃矮病抗病性調(diào)查時，建議盡量在黃矮癥狀典型期進行發(fā)病株數(shù)與嚴重度調(diào)查。對于春季接種病毒，一般拔節(jié)期至揚花期癥狀開始出現(xiàn)，灌漿期癥狀表現(xiàn)明顯，到乳熟期，由于光合營養(yǎng)逐步進入籽粒中，導致葉片普遍衰老黃化，從而掩蓋了黃矮癥狀，容易造成調(diào)查結(jié)果數(shù)據(jù)偏大。本研究發(fā)現(xiàn)，病害調(diào)查時間在灌漿期進行比較合適，此時黃矮病癥狀特征明顯，而生理性黃化尚未出現(xiàn)。更多相關(guān)研究還需進一步深入探索。