田濤 魯雅潔 姚俊 曹新 魏欽俊 李琦,3

據(jù)估計(jì)，約70%的遺傳性聽力損失(hereditary hearing loss， HHL)是非綜合征型(nonsyndromic autosomal hearing loss, NSHL)，其余30%被歸類為綜合征型聽力損失[1，2]。常染色體隱性遺傳類型的NSHL(autosomal recessive NSHL，ARNSHL)通常表現(xiàn)為語(yǔ)前聾，約占聽力損失患者的80%，而常染色體顯性遺傳NSHL(autosomal dominant NSHL，ADNSHL)大部分是漸進(jìn)性語(yǔ)后聽力損失，約占20%[3]。目前至少有100個(gè)耳聾相關(guān)基因已被鑒定，其中包括36個(gè)ADNSHL相關(guān)基因(http://hereditaryhearingloss.org，09/2017)。由于ADNSHL多為散發(fā)且家系罕見，其HHL的分子診斷仍然具有挑戰(zhàn)性[4]。

以往耳聾家系致病基因的鑒定主要采用候選基因篩選和連鎖分析定位克隆等技術(shù)，復(fù)雜而且時(shí)間較長(zhǎng)，存在一定的局限性。目前，全外顯子組測(cè)序已成為闡釋HHL復(fù)雜性的最合適和最可靠的工具[5～7]。故本研究采用全外顯子組測(cè)序調(diào)查一個(gè)中國(guó)ADNSHL家系(JSNY-067)的遺傳病因，發(fā)現(xiàn)了MYO基因的新致病性變異，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1家系資料 一個(gè)6代共52人的ADNSHL大家系(圖1，編號(hào)為JSNY-067家系)，家系調(diào)查和聽力學(xué)檢測(cè)由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科完成。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)人類研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有家系成員已經(jīng)書面簽字同意赫爾辛基宣言的所有原則。

該家系六代居住于江蘇省，14例表現(xiàn)為語(yǔ)后ADNSHL，均為雙側(cè)對(duì)稱的感音神經(jīng)性聽力損失，聽閾圖表現(xiàn)為平坦型或者高頻下降型；聽力損失程度似乎與個(gè)體的年齡相關(guān)，家系中聽力損失者均主訴聽力障礙在學(xué)齡時(shí)出現(xiàn)，隨著年齡增加聽力損失呈進(jìn)行性加重，早期為中高頻聽力損失，逐漸影響所有頻率呈平坦型聽閾曲線，兩名年齡最小的患者(5歲和10歲患者)感音神經(jīng)性聽力損失僅影響中低頻，其中2例(Ⅳ3、Ⅴ3)典型聽閾圖見圖2。

所有聽力損失者其他耳鼻咽喉科?？茩z查均正常，無(wú)耳毒性藥物應(yīng)用史和噪聲暴露史，無(wú)主觀和客觀的前庭功能障礙表現(xiàn)，無(wú)耳鳴，鼓室導(dǎo)抗圖正常，全身檢查神經(jīng)系統(tǒng)正常，未發(fā)現(xiàn)視力障礙和視網(wǎng)膜病變。

1.2DNA提取和全外顯子組測(cè)序 抽取所有參與調(diào)查家系成員的外周靜脈血，按照標(biāo)準(zhǔn)程序提取基因組DNA。使用DNA提取試劑盒(DP319，Tiangen，Beijing，China)從受試者的血液中提取基因組DNA,使用耳聾基因變異檢測(cè)試劑盒(Capital Bio Corporation，Beijing，China )檢測(cè)中國(guó)人群四種常見耳聾基因(GJB2、SLC26A4、GJB3和MT-RNR1)中的9種熱點(diǎn)致病性變異，包括：GJB2的35delG、176del16、235delC、299delAT, GJB3的538C>T，SLC26A4的2168A>G、919-2A>G, MT-RNR1的1494C>T、1555A>G[8]。

圖1 JSNY-067家系的家系圖 黑色箭頭是先證者

圖2 2例典型聽力損失患者(Ⅳ3、Ⅴ3)的聽閾圖 平均聽閾(pure tone audiometry,PTA)分別為58.3 dB HL(Ⅳ3)、41.7 dB HL(Ⅴ3)

參照說(shuō)明書， 將約3 μg純化的gDNA片段化至200 bp，對(duì)文庫(kù)制備進(jìn)行末端修復(fù)，腺苷酸化和銜接子連接。使用TruSeq DNA LT / HT樣品制備試劑盒和TruSeq Exome Enrichment Kit富集外顯子組，合并等量的文庫(kù)樣品，然后與定制的捕獲陣列雜交，包括外顯子、剪接位點(diǎn)和立即融合內(nèi)含子序列。 在Illumina HiSeq 2500上進(jìn)行測(cè)序，用于變異鑒定和隨后的分析。 Samtools mpileup識(shí)別變體并標(biāo)記SNP和插入缺失，ANNOVAR用于注釋基因。

1.3Sanger測(cè)序和變異功能分析 運(yùn)用Sanger測(cè)序?qū)SNY-067家系的所有成員的樣品進(jìn)行測(cè)序以確定變異基因中的致病性變異，尤其是MYO6基因致病性變異。 使用BigDye Terminator v3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并使用ABI 3700XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。MYO6測(cè)序的引物如下：MYO6-正向：5'TGTCCCGCCCATGTTAATAT 3'; MYO6反向：5'TGCACCGTACCTCAACACAG 3'。

1.4變異位點(diǎn)保守性分析 使用SIFT、Polyphen2、PROVEAN和MutationTaster軟件來(lái)確定影響表型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能變化。使用Clustal X1.83軟件比較人類野生型MYO6蛋白序列與來(lái)自黑猩猩、小家鼠、抹香鯨、野豬、食蟹猴、雙峰駱駝、鼠耳蝙蝠、埃及果蝠、牛、大熊貓、白豚、八齒鼠、原雞和熱帶爪蟾的MYO蛋白序列(序列見http://www.ensembl.org/)，并研究這種蛋白質(zhì)的進(jìn)化保護(hù)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1JSNY-067家系聽力損失特點(diǎn) JSNY-067家系中14例語(yǔ)后ADNSHL患者中1例(Ⅲ10)已經(jīng)去世，未測(cè)聽力，其余13例的聽力損失發(fā)生年齡及特點(diǎn)見表1，可見，聽力損失程度隨年齡增長(zhǎng)呈逐漸加重的趨勢(shì)，年齡越小，聽力損失程度越輕，年齡越大，聽力損失程度越重。

2.2基因檢測(cè)結(jié)果 為了搜尋耳聾候選基因，本研究對(duì)該家系的一例聽力正常(Ⅲ13)個(gè)體和兩例聽力損失(Ⅳ3和Ⅴ3)個(gè)體的DNA進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序。 每例個(gè)體平均生成46.7億個(gè)堿基，目標(biāo)區(qū)域的平均測(cè)序深度約為97個(gè)，以滿足單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失的要求。 將測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI人參考基因組進(jìn)行比對(duì)，并與包含來(lái)自1000基因組計(jì)劃試驗(yàn)數(shù)據(jù)的dbSNP138，來(lái)自八個(gè)測(cè)序的HapMap個(gè)體和來(lái)自YH數(shù)據(jù)庫(kù)的10個(gè)個(gè)體進(jìn)行比較。

表1 JSNY-067家系13例聽力損失患者的聽力損失發(fā)生年齡、特點(diǎn)及程度

在2例個(gè)體總共發(fā)現(xiàn)了7 898種變異，其中5 760個(gè)是非同義變異，包括剪切位點(diǎn)變異、點(diǎn)變異以及插入缺失。 然后將這些變異根據(jù)以下原則進(jìn)行篩選：①變體的等位基因頻率cuto(在dbSNP138，HapMap，1000基因組和本地?cái)?shù)據(jù)集中小于0.01);②在所有受影響的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的變異，在未受影響的個(gè)體中沒有發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步將候選變異縮減為25個(gè)錯(cuò)義變異。

通過(guò)Sanger測(cè)序篩選譜系樣本中發(fā)現(xiàn)的25個(gè)變異，在MYO6基因的外顯子8中發(fā)現(xiàn)了與該疾病共分離的錯(cuò)義變異c.622A> G(p.K208E)(圖3)，該變異在該家系中13個(gè)聽力損失成員中發(fā)現(xiàn)，但在21個(gè)聽力正常的家系成員中未發(fā)現(xiàn)。 為了評(píng)估其是否為致病性變異，進(jìn)一步測(cè)序了500個(gè)漢族健康人和300個(gè)散發(fā)性耳聾病例，均未發(fā)現(xiàn)c.622A> G變異。

2.3變異位點(diǎn)保守性分析結(jié)果 為了預(yù)測(cè)該變異的可能致病性，本研究分析了氨基酸替換的進(jìn)化保守性和破壞性效應(yīng)， 結(jié)果顯示，該變異在多種脊椎動(dòng)物物種間高度保守，MYO6蛋白中208位的Pro殘基在多種脊椎動(dòng)物物種中高度保守(圖3b)，當(dāng)這個(gè)位置改變時(shí)，引起致病性變異的可能性大大增加。進(jìn)一步在計(jì)算機(jī)中使用SIFT，Polyphen2，PROVEAN和MutationTaster軟件預(yù)測(cè)了變異危害的可能性，預(yù)測(cè)分析的結(jié)果見表2。MYO6基因編碼非常規(guī)肌球蛋白VI，可以分為三個(gè)區(qū)域：N-末端運(yùn)動(dòng)區(qū)域，接頭結(jié)構(gòu)域和單個(gè)IQ基序組成的頸部結(jié)構(gòu)域，以及具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的C末端尾區(qū)域。p.K208E變異可能影響驅(qū)動(dòng)子部位的截短蛋白(圖3b)，表明，MYO6新的變異c.622A> G(p.K208E)可能是這個(gè)家系發(fā)生聽力損失的原因。

表2 JSNY-067家系MYO6基因的致病性變異特性

注：a.得分范圍從0(有害)到1(中性)，截止分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.05。b.負(fù)分和正分分別表示有害和中性，截止分?jǐn)?shù)設(shè)置為-2.5。 評(píng)分等于或低于-2.5的變異被認(rèn)為是“有害的”，高于-2.5被認(rèn)為是“中性的”。c.HGMD(Human Gene Mutation Database，人類基因變異數(shù)據(jù)庫(kù))

圖3 JSNY-067家系MYO6基因的變異分析 a.野生型和c.622A> G變異對(duì)照的DNA序列。b.由運(yùn)動(dòng)、IQ和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的肌球蛋白VI的圖結(jié)構(gòu), 顯示p.K208E變異在驅(qū)動(dòng)子頭部區(qū)域中映射,保守性分析表明,肌球蛋白VI蛋白中208位的Pro殘基在多種脊椎動(dòng)物物種中保守

3 討論

聽力損失的基因診斷目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是由于遺傳異質(zhì)性使得分子診斷昂貴而耗時(shí)。全外顯子組測(cè)序是鑒定孟德爾遺傳中的致病基因變異的有效方法，與Sanger測(cè)序相比，具有明顯的成本效益性[9]。本研究對(duì)一個(gè)中國(guó)耳聾家系進(jìn)行研究，該家系聽力損失患者表現(xiàn)為漸進(jìn)性的語(yǔ)后聾，符合ADNSHL的遺傳學(xué)特征，通過(guò)對(duì)該家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，成功鑒定了導(dǎo)致該家系遲發(fā)性聽力損失的新的MYO6變異c.622A> G(p.K208E)。

MYO6基因位于染色體6q14.1，含有35個(gè)外顯子，構(gòu)成3 858個(gè)多核苷酸編碼區(qū)[10]。已知MYO6基因中的變異可以引起ADNSHL(DFNA22)和ARNSHL(DFNA37)。 迄今為止，全世界許多國(guó)家的不同DFNA22家族報(bào)道了11種MYO6致病變異[11]，MYO6致病 變異似乎在外顯子2～35中自由分布，只有兩個(gè)突變(p.Arg205Stop，p.Arg205Gln)位于p.K208E附近，臨床表型均不是ADNSHL。MYO6基因編碼非常規(guī)肌球蛋白-VI，其是一種反向運(yùn)動(dòng)蛋白，向肌動(dòng)蛋白絲的負(fù)端移動(dòng)，并在細(xì)胞內(nèi)囊泡和細(xì)胞器運(yùn)輸中發(fā)揮作用[12]。 蛋白質(zhì)由含有ATP-和肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)區(qū)域和與其他蛋白質(zhì)相互作用的球狀尾巴組成[13]。 肌球蛋白-VI有助于維持內(nèi)耳毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和適當(dāng)?shù)墓δ?，MYO6錯(cuò)義變異可能抑制野生型肌球蛋白VI二聚化并抑制其功能[14]。

在本研究JSNY-067家系中，先證者(Ⅴ3)具有雙側(cè)對(duì)稱的感音神經(jīng)性聽力損失，聽閾圖呈高頻下降型，10歲左右開始發(fā)病，2例年齡最小的受影響受試者(5歲和10歲)感音神經(jīng)性聽力損失僅影響中低頻，隨后聽力損失漸進(jìn)性發(fā)展，受影響的家庭成員表現(xiàn)為早期僅高頻聽力下降，隨著年齡增加全頻聽力下降。染色體6q13上的MYO6基因的外顯子8中鑒定發(fā)生了錯(cuò)義變異c.622A> G，這導(dǎo)致用蛋白質(zhì)殘基208 (K208E)處的谷氨酸置換賴氨酸。在500例漢族健康人和300例散發(fā)耳聾病例均未發(fā)現(xiàn)p.K208E變異，考慮MYO6基因的c.622A>G(p.K208E)變異是JSNY-067家系的致病變異，該變異型肌球蛋白Ⅵ可能導(dǎo)致ADNSHL，其影響蛋白質(zhì)的致病性還有待進(jìn)一步研究。