孔 龍 鄒 琦 程時焰 楊嚴鷗 余登航 黃 峰 董桂芳

(1. 武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院, 動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室, 武漢 430023; 2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 3. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 合肥 230036)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)作為我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的品種之一, 在2016年產(chǎn)量已達到5.89×109kg, 占淡水水產(chǎn)品養(yǎng)殖總量的18.55%[1]。然而, 隨著配合飼料在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用越來越廣泛, 養(yǎng)殖魚類發(fā)生營養(yǎng)性脂肪肝的機率亦隨之增加, 其中, 草食性魚類, 如草魚的發(fā)病率更高[2]。營養(yǎng)性脂肪肝可導致養(yǎng)殖魚類體脂增加, 影響魚肉品質(zhì); 同時, 肝臟上過多的脂肪沉積可導致肝細胞病變和壞死, 魚體抗脅迫能力和免疫力下降, 魚類極易暴發(fā)疾病甚至死亡, 在高溫季節(jié)更為嚴重, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[3]。因此, 尋找有效防治魚類營養(yǎng)性脂肪肝的綠色調(diào)節(jié)劑是當前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關鍵科學問題之一。

CLA是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱, 其含有多種構(gòu)型, 其中c9、t11 CLA和t10、c12 CLA是CLA最常見的活性異構(gòu)體[4]。近年來, CLA因具有緩解動脈粥樣硬化、降低炎癥反應、降低肥胖發(fā)生率和改善糖尿病等作用而被廣泛關注[5],且CLA已于2009年被我國衛(wèi)生部批準作為食品添加劑。研究表明, 在飼料中添加1%的CLA可顯著降低雜交鱸(Morone saxatilis)、黃鱸(Perca flavescens)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)肝脂含量[6—8],而對鯉魚(Cypriniformesspp)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)肝脂含量無顯著影響[9—13], 這表明CLA對不同魚類肝臟脂肪積累的生理效應不盡相同。

不僅如此, 即使是同種魚類, 其規(guī)格不同,CLA對其肝脂、肌肉脂肪和體脂含量的生理效應也出現(xiàn)了不同的結(jié)果, 如: Zuo等[14]研究發(fā)現(xiàn), 在均重為7.26 g的大黃魚(Pseudosciaena crocea)飼料中添加0.84%—1.70% CLA, 其體脂和肌肉脂肪含量均顯著上升, 而趙占宇等[15]研究表明, 在均重為150 g的大黃魚飼料中添加1%—4% CLA替代魚油, 其體脂、肝脂和肌脂有均呈下降的趨勢, 但不顯著;Kennedy等[16]研究發(fā)現(xiàn), 在均重為87.5 g的大西洋鮭(Salmo salar)飼料中添加2% CLA替代魚油可顯著增加其肝臟和肌肉脂肪含量; 而Leaver等[17]研究表明, 在均重為132 g的大西洋鮭飼料中添加2%CLA替代魚油對其體脂和肝脂含量無顯著影響, 而添加量達到4%時, 顯著降低其體脂和肝臟甘油三酯含量。上述研究表明, 同種魚類不同生長階段對CLA的生理效應不同。

另外, Dong等[18]的研究表明, 在飼料中添加2.5% CLA在不影響草魚健康的前提下, 可顯著降低其肝臟和肌肉脂肪含量。然而, 在該研究中, 飼料配方含有魚粉和魚油, 魚粉和魚油又含有其他已報道的具有降脂功效的多不飽和脂肪酸, 如EPA和DHA, 可能會干擾其實驗結(jié)果。為進一步確定CLA可否顯著降低草魚肝臟和肌肉脂肪積累, 本實驗采用無魚粉和魚油的飼料配方, 通過在草魚飼料中添加不同濃度的CLA, 并采用成分單一的飽和脂肪酸-椰子油平衡總的脂肪含量, 研究CLA對草魚肝臟和肌肉細胞學形態(tài)、抗氧化能力以及脂肪代謝相關基因表達的影響, 進一步確定不同濃度的CLA能否在不影響草魚健康的前提下, 可增加其組織抗氧化能力并提高其組織脂肪分解代謝基因以及降低組織合成代謝相關脂肪代謝基因表達, 為確定CLA能否作為有效防治草魚營養(yǎng)性脂肪肝的綠色添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與實驗飼料

草魚購自安徽省合肥市丙子養(yǎng)殖場, 實驗魚在進入實驗室后, 在10個玻璃缸中馴養(yǎng)至少20d。馴養(yǎng)期間, 每天用對照組飼料(表 1)飽食投喂2次(09:00和15:00)。共配制7種近似等氮(粗蛋白: 36 g/100 g)等脂(粗脂肪: 4.5 g/100 g)飼料: 0 (對照組)、0.5 (CLA0.5)、1 (CLA1)、1.5 (CLA1.5)、2 (CLA2)、2.5 (CLA2.5)和3 g/100 g CLA (CLA3)。每組飼料中均添加1 g/100 g的亞油酸和0.5 g/100 g的亞麻酸作為草魚必需脂肪酸源, 采用椰子油填充不同梯度的CLA以確保每組飼料中粗脂肪含量一致。飼料配方以及化學組成見表 1, 實驗用CLA、椰子油以及飼料中脂肪酸組成見表 2。使用飼料制粒機將實驗飼料擠壓成直徑為1—3 mm的顆粒, 60℃烘干,-10℃保存。

1.2 生長實驗及取樣方法

本實驗的生長實驗與Zou等[19]的生長實驗為同一個實驗。生長實驗在21個圓形塑料缸(直徑為:60 cm, 容積為: 190 L)的循環(huán)系統(tǒng)中進行。實驗開始前, 將初始體重為(5.08±0.08) g (平均值±標準誤)的實驗魚禁食24h, 然后隨機選取體質(zhì)健壯、規(guī)格一致的實驗魚, 每缸40尾, 每個飼料組設置3個實驗缸, 同時取3組魚(每組10尾) 作為初始魚體組成樣本。養(yǎng)殖實驗持續(xù)65d。投喂方法和養(yǎng)殖條件均與Zou等[19]相同。生長實驗結(jié)束前1天, 將實驗魚停喂24h, 采用MS-222 (200 mg/L, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)將實驗魚麻醉并稱重。然后, 隨機從每個實驗缸中選取15尾實驗魚, 冰盤上解剖, 取其肝臟和背部白肌, 用于其細胞學形態(tài)觀察、抗氧化酶活力和脂肪代謝相關基因表達分析。

1.3 生化成分分析

采用Zou等[19]描述的方法測定飼料中的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量及總能量。將7種飼料冷凍干燥后研磨成粉末, 隨后提取總脂質(zhì), 甲基化成脂肪酸甲酯, 依據(jù)Zou等[19]描述的方法測定脂肪酸甲酯并計算出脂肪酸含量。以上每項檢測至少3個重復。

1.4 肝臟和肌肉組織細胞學形態(tài)觀察

將肝臟和肌肉樣品于2.5%戊二醛中固定48h,隨后, 切成1 mm3的塊狀并用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)漂洗3次, 然后在1%四氧化鋨水溶液固定1h后取出, 再用磷酸緩沖液沖洗, 然后在50%—100%梯度酒精中脫水并包埋在Epon 812中。用UCT8切片機制作超薄切片, 然后用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色, 透射電鏡(FEI Tecnai, G2 F20 S-TWIN,Eindhoven, The Netherlands)觀察。

表 1 飼料配方和基本化學組成(g/100 g 干物質(zhì))Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (g/100 g in dry matter)

1.5 肝臟和肌肉組織抗氧化酶類的酶活力、總抗氧化能力和丙二醛含量檢測

將肝臟和肌肉樣品在0.65%的冷生理鹽水中勻漿。隨后在4℃, 6000 r/min, 離心15min, 取上清液,用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)。所有檢測均采用南京建成生物工程研究所試劑盒及相關說明測定, 對應試劑盒編號分別為: No.A001、No. A007、No. A005、No. A062、No.A015和No. A003。組織勻漿的總蛋白含量依據(jù)Bradford[20]的方法以牛血清白蛋白為標準蛋白測定。每項測定至少有3個生物學重復。

1.6 肝臟和肌肉組織脂肪代謝相關基因mRNA相對表達量的檢測

根據(jù)Zou等[19]描述的方法用Trizol提取肝臟和肌肉總RNA, 然后測定其濃度并鑒定其質(zhì)量。草魚的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸脫氫酶2(FAD2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和β-actin(內(nèi)參)的引物序列如表 3所示, 然后由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗數(shù)據(jù)先經(jīng)過正態(tài)性檢驗和同質(zhì)性檢驗, 然后對平均值進行單因素方差分析(one-way ANOVA)后, 再進行Duncan’s多重比較, 在P＜0.05時檢驗差異的顯著性。方差分析以及飼料中CLA水平與其肝臟和肌肉中抗氧化酶活力以及脂肪代謝相關基因mRNA表達水平的相關性分析均由SPSS18.0 (SPSS PASW Statistics, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)完成。

表 2 脂肪原料(g/100 g油) 和飼料(g/100 g干物質(zhì))的脂肪酸組成Tab. 2 Fatty acid compositions of oils (g/100 g of oil) and experimental diets (g/100 g in dry matter)

2 結(jié)果

本實驗與Zou等[19]的生長實驗為同一個實驗,其中, 共軛亞油酸對草魚生長性能和飼料利用的影響已發(fā)表。其結(jié)果簡述如下: 在飼料中添加0.5%—3% CLA不影響草魚的存活率(P＞0.05, 表4)。1%CLA組的攝食率顯著高于對照組(P＜0.05),而2.5%—3%CLA組的攝食率顯著低于對照組(P＜0.05, 表 4)。飼料中0.5%—2% CLA對草魚特定生長率、飼料轉(zhuǎn)化效率、蛋白儲積率和能量儲積率均無顯著性影響(P＞0.05), 但2.5%—3% CLA分別顯著降低其上述指標(P＜0.05, 表 4)。如表 5所示(該數(shù)據(jù)已發(fā)表, 見Zou等[19]), 飼料中添加0.5%—3%CLA對草魚全魚干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、灰分和能量含量均無顯著性影響(P＜0.05)。飼料中1.5%—3%CLA、1%—3%CLA和1.5%—3%CLA分別顯著降低肝臟、腹腔脂肪組織和肌肉中的脂肪含量(P＜0.05)。

2.1 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉組織中細胞學形態(tài)的影響

不同CLA添加水平對草魚肝組織細胞超微結(jié)構(gòu)的影響如圖 1所示。對照組草魚肝細胞的超微結(jié)構(gòu)正常(圖 1a)。細胞雙層膜結(jié)構(gòu)完整, 細胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細胞器均清晰可見。CLA0.5-CLA2.5組肝細胞雙層膜結(jié)構(gòu)完整, 細胞核呈球形,染色質(zhì)均一; 線粒體呈囊狀結(jié)構(gòu), 內(nèi)嵴清晰; 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊, 核糖體附著均勻(圖 1b—f)。而CLA3組肝細胞線粒體空泡化, 內(nèi)嵴大部分消失; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹, 排列過于緊密, 結(jié)構(gòu)異常(圖 1g)。不同CLA添加水平對草魚肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響如圖 2所示。對照組草魚肌細胞超微結(jié)構(gòu)正常(圖 2a)。肌節(jié)結(jié)構(gòu)緊密, 肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰。CLA0.5-CLA2.5組草魚肌細胞結(jié)構(gòu)與對照組一致, 未出現(xiàn)異常(圖 2b—f)。而CLA3組肌細胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)松散, 肌原纖維降解, 結(jié)構(gòu)異常(圖 2g)。

2.2 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉中抗氧化酶類活力、T-AOC和MDA含量的影響

由表 6可知, 與對照組相比, CLA1-CLA3組肝臟中SOD活力顯著上升(P＜0.05), 其中在CLA2和CLA3組最為顯著; 在CLA1.5-CLA3組肝臟中CAT、GPx和T-AOC活力顯著高于對照組(P＜0.05),且這3種酶酶活力在CLA2組均達到最高, 而GR活力在CLA0.5-CLA3組無顯著變化(P＞0.05)。CLA0.5-CLA1組肝臟中MDA含量與對照組MDA含量接近(P＞0.05), 但CLA1.5-CLA2肝臟中組MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05), 而CLA2.5-CLA3組MDA含量顯著高于對照組(P＜0.05)。由表 7可知,與對照組相比, 在CLA1.5-CLA3組肌肉中SOD活力顯著提高(P＜0.05), 且在CLA2組達到最高; GPx活力在CLA1-CLA3組肌肉中顯著提高(P＜0.05), 且在CLA2.5組最為顯著; 在CLA1.5-CLA2.5組肌肉中TAOC活力顯著高于對照組(P＜0.05), 且在CLA2組中達到最高, 而在CLA0.5-CLA3組肌肉中CAT和GR活力均無顯著變化(P＞0.05)。CLA0.5-CLA2.5組肝臟中MDA含量與對照組MDA含量均無顯著性差異(P＞0.05), 但CLA3組MDA含量顯著高于對照組(P＜0.05)。

表 3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物序列Tab. 3 Primers used for real-time quantitative PCR (qRT-PCR)

2.3 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉中脂肪代謝相關基因mRNA表達的影響

由圖 3可知, 與對照組相比, 在CLA1.5-CLA3組肝臟中ACCmRNA表達顯著下調(diào)(P＜0.05), 而HSLmRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.05), 且前者在CLA2.5組中達到最高, 而后者在CLA2-CLA3組降至最低;FAD2、LPL、PPARαmRNA分別在CLA2-CLA3組、CLA1.5-CLA2.5組和CLA1-CLA3組肝臟中顯著上調(diào)表達(P＜0.05), 而PPARγmRNA在CLA1-CLA3組肝臟中顯著下調(diào)表達(P＜0.05), 且與對照組相比, 這4個基因mRNA表達量差異性分別在CLA2-CLA2.5、CLA2.5、CLA2和CLA2-CLA3組中最為顯著。由圖 4可知, 與對照組相比,在CLA1-CLA3組肌肉中ACCmRNA表達顯著下調(diào)(P＜0.05), 而LPL、HSL和PPARαmRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.05), 且依次在CLA2.5-CLA3、CLA1.5-CLA3、CLA2-CLA3和CLA2組肌肉中最為顯著;在CLA1.5-CLA2以及CLA3組肌肉中FAD2 mRNA表達量顯著高于對照組(P＜0.05), 而在CLA0.5-CLA3組肌肉中PPARγmRNA表達無顯著影響(P＞0.05)。

2.4 飼料中CLA水平與其肝臟和肌肉中抗氧化酶活力以及脂肪代謝相關基因mRNA表達水平的相關性分析

飼料中CLA水平與其肝臟和肌肉中抗氧化酶類活力以及脂肪代謝相關基因mRNA表達水平的相關性分析分別見表 8—11。由表 8可知, 肝臟中所檢測的5種酶中, GR活力和飼料中CLA水平呈負相關, 其他4種酶活力均和CLA水平呈正相關; 5種酶活力之間, 除GR與GPx、GR與T-AOC之間的酶活力呈負相關, 其他相關性均為正相關。飼料中CLA水平與肝臟中MDA含量呈負相關。由表 9可知, 在肌肉中所檢測的5種酶中, GR活力和CLA水平呈負相關, 其他4種酶活力均和CLA水平呈正相關; 5種酶活之間, 除GR與CAT、GR與T-AOC之間的酶活力呈負相關, 其他相關性均為正相關。飼料中CLA水平與肌肉中MDA含量也呈顯著負相關。由表 10可知, 在肝臟中所檢測的6個基因(ACC、FAD2、LPL、HSL、PPARα和PPARγ) mRNA表達量中,ACCmRNA表達量和CLA水平呈負相關, 其余5個基因mRNA表達量均和CLA水平呈正相關。ACC與其他5個基因mRNA表達量均呈負相關, 而其他5個基因mRNA表達量之間相互均成正相關。由表 11可知, 在肌肉中, CLA水平和6個基因mRNA表達量互相之間的相關性與肝臟中的結(jié)果一致。

表 4 飼料中共軛亞油酸對生長和飼料利用的影響(平均值±標準誤, n=3)＊Tab. 4 Effects of dietary CLA on growth and feed utilization of grass carp (mean ± SE, n = 3)*

表 5 飼料中共軛亞油酸對草魚全魚組成和組織脂肪含量的影響(平均值±標準誤, n = 3)Tab. 5 Whole body composition and tissue lipid content of grass carp fed with the experimental diets (mean ± SE, n = 3)

3 討論

本實驗參考NRC[21]草魚營養(yǎng)需求和Du等[22]配制粗蛋白含量為36%, 粗脂肪含量為4.5%等氮等脂飼料, 其中, 采用僅含飽和脂肪酸的椰子油替代CLA, 確保每組飼料粗脂肪含量一致, 并添加必需脂肪酸(1%亞油酸和0.5%亞麻酸)以滿足其必需脂肪酸需求。經(jīng)過65d的生長實驗, 對照組實驗魚[體重為(5.08±0.08) g]的特定生長率約為2.11%/d, 高于Du等[22]已報道的草魚特定生長率(攝食4%粗脂肪含量的精制飼料70d后,SGR約為1.30%/d)。上述數(shù)據(jù)表明, 本實驗的飼料配方完全可滿足草魚正常生長的需求, 且本飼料配方適合用來研究CLA可否降低肝臟和肌肉中脂肪積累。

圖 1 飼料中CLA對草魚肝臟組織細胞學形態(tài)的影響(透射電鏡, 3500×)Fig. 1 The effect of dietary CLA on the morphology of hepatocytes of grass carp (Transmission electron microscope, 3500×)

圖 2 飼料中CLA對草魚肌肉組織細胞學形態(tài)的影響(透射電鏡, 橫切, 3500×)Fig. 2 The effect of dietary CLA on the morphology of myocytes of grass carp (Transmission electron microscope, cross section, 3500×)

表 6 飼料中CLA對草魚肝臟中抗氧化酶類活力、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響(平均值±標準誤, n=3)＊Tab. 6 Effects of dietary CLA on activity of antioxidant enzymes, T-AOC and MDA contents in the liver of grass carp (mean±SE, n=3)*

3.1 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉組織細胞學形態(tài)的影響

丁志麗等[23]研究發(fā)現(xiàn), 日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在攝入高于4.5% CLA時, 其肝胰腺中

MDA (丙二醛) 含量顯著增加, 而MDA是機體脂質(zhì)過氧化的重要標志之一[24]。因此, 高劑量的CLA可通過引起日本沼蝦肝胰臟中MDA含量的增加, 進而引起機體脂質(zhì)過氧化, 從而導致魚體的氧化應激, 并最終導致魚體的組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn),CLA3組草魚肝組織細胞線粒體空泡化; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹; 肌細胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)松散, 肌原纖維降解, 這表明CLA3組草魚肝細胞和肌細胞形態(tài)均受損。同時,本研究也發(fā)現(xiàn), CLA3組肝臟和肌肉中MDA含量顯著高于其他各組。這可能是由于CLA添加水平過高, 導致CLA通過Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶合成花生四烯酸, 而花生四烯酸能通過抑制線粒體呼吸鏈中的復合酶的活性等多種途徑誘導氧化應激, 產(chǎn)生活性氧自由基[25], 導致草魚肝臟和肌肉細胞受損。因此, 結(jié)合2%CLA在不影響草魚的生長和飼料利用, 且顯著降低肝臟脂肪積累, 建議草魚飼料CLA的添加量應低于3%, 以確保魚體正常生長。

表 7 飼料中CLA對草魚肌肉中抗氧化酶類活力、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響(平均值±標準誤, n =3)＊Tab. 7 Effect of dietary CLA on activity of antioxidant enzymes, T-AOC and MDA contents in the muscle of grass carp (mean±SE, n=3)*

圖 3 飼料中CLA對草魚肝臟脂肪代謝相關基因mRNA表達的影響Fig. 3 Effects of dietary CLA on mRNA level of genes involved in the lipid metabolism in the liver of grass carp

圖 4 飼料中CLA對草魚肌肉脂肪代謝相關基因mRNA表達的影響Fig. 4 Effects of CLA on mRNA level of genes involved in the lipid metabolism in the muscle of grass carp

表 8 飼料中CLA水平與肝臟中抗氧化酶類活力、總抗氧化能力和丙二醛含量的相關性Tab. 8 Pearson correlations between dietary CLA level and the activity of antioxidant enzymes, T-AOC and MDA contents in the liver of grass carp

3.2 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉中抗氧化酶類活力、總抗氧化能力和MDA含量的影響

魚類在長期的進化過程中, 已發(fā)展出完備的抗氧化酶系統(tǒng)(如SOD、CAT、GPx和GR), 并能利用抗氧化物質(zhì)(如維生素C、維生素E和GSH) 來清除機體氧化還原反應產(chǎn)生的活性氧自由基, 如超氧陰離子自由基和羥自由基等, 減輕機體的氧化應激[26,27],以維持細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[28]。SOD是機體抵御氧化應激的第一道防線, 將活性氧自由基還原成H2O2[29]。CAT則能夠?qū)OD的還原產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2， GPx能通過氧化還原性質(zhì)清除H2O2和脂質(zhì)過氧化物從而保護機體不受氧化損傷[30]。本研究表明, 在CLA1.5-CLA3組草魚肝臟和肌肉中, SOD和GPx活力均顯著高于對照組, 在CLA1-CLA3組肝臟中, CAT活力顯著高于對照組, 而在肌肉中, CAT活力無顯著差異。與本實驗結(jié)果相似,在規(guī)格為146.25 g的大黃魚飼料中添加1%—4%CLA可顯著提高其肝臟和肌肉中SOD活力[15]。同樣, Huang等[31]研究表明, 在黃姑魚(Nibea coibor)幼魚飼料中添加0.5%—2% CLA可顯著提高其肝臟SOD、CAT和T-AOC活力。然而, 丁志麗等[23]研究發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加2% CLA替代魚油顯著降低日本沼蝦肝胰腺SOD和GPx活力, 這可能是由于飼料中CLA替代魚油所致, 因為魚油含有其他多不飽和脂肪酸, 如n-3PUFA和n-6PUFA, CLA替代魚油后導致n-3和n-6脂肪酸比例失衡。然而, Fracalossi等[32]認為當機體n-3和n-6 PUFA比例達到一定平衡時,機體才具有最佳免疫力, 因此CLA替代魚油后反而引起日本沼蝦肝胰腺SOD和GPx活力下降。

表 9 飼料中CLA水平與肌肉中抗氧化酶類活力、總抗氧化能力和丙二醛含量的相關性Tab. 9 Pearson correlations between dietary CLA level and the activity of antioxidant enzymes, T-AOC and MDA contents in the muscle of grass carp

表 10 飼料中CLA水平與肝臟中脂肪代謝相關基因mRNA表達的相關性Tab. 10 Pearson correlations between dietary CLA level and mRNA levels in the liver of grass carp

T-AOC是用于評估機體抗氧化系統(tǒng)抗氧化功能的綜合性指標, 其大小反映機體應對外來脅迫的代償能力和體內(nèi)自由基的代謝情況[33]。與Huang等[31]研究結(jié)果相同, 在CLA1.5-CLA2.5組中, 草魚肝臟和肌肉T-AOC活力顯著上調(diào)。本研究表明, 這5種酶活力在肝臟中, T-AOC活力與CLA相關性最強,而在5種酶活力之間, T-AOC活力與SOD相關性最強; 這5種酶活力在肌肉中, GPx與CLA活力相關性最強, 而在5中酶活力之間, GPx活力與SOD相關性最強, 這表明在肝臟和肌肉組織中, CLA對同一抗氧化酶的影響并不一致, 但對SOD活力均有較大影響, SOD在CLA發(fā)揮抗氧化功效中有至關重要的作用。由于CLA2組肝臟SOD、CAT、GPx、T-AOC和肌肉SOD、T-AOC活力上調(diào)均最為顯著, 因此,CLA2組為可顯著提高草魚應對脅迫, 清除體內(nèi)過氧化應激產(chǎn)物(如超氧離子、過氧化氫和丙二醛等)的能力, 有利于魚體應對氧化應激, 減少損傷的CLA最適添加組。

表 11 飼料中CLA水平與肌肉中脂肪代謝相關基因mRNA表達的相關性Tab. 11 Pearson correlations between dietary CLA level and mRNA levels in the muscle of grass carp

3.3 飼料中不同CLA添加水平對草魚肝臟和肌肉脂肪代謝相關基因mRNA表達的影響

動物體內(nèi)的脂質(zhì)積累是體外脂質(zhì)的攝入, 參與體內(nèi)脂質(zhì)合成(包括脂肪酸從頭合成, 如ACC和脂肪酸去飽和酶, 如FAD2)、脂蛋白轉(zhuǎn)運(如LPL)、脂肪酸β氧化(如HSL)等關鍵酶和脂肪酸代謝相關的轉(zhuǎn)錄因子(如PPARα、PPARγ) 共同調(diào)控的結(jié)果。ACC是催化乙酰CoA形成丙二酰輔酶A的限速酶, 參與脂肪酸從頭合成[34]。本研究表明, CLA1.5-CLA3組草魚肝臟和肌肉ACCmRNA表達量顯著下調(diào)。上述結(jié)果與Zou等[19]1.5%—3% CLA顯著降低草魚肝臟和肌肉中脂肪積累一致。Dong等[18]研究表明, 在草魚飼料中添加1.5%—3% CLA可顯著降低其肝臟和肌肉ACCmRNA表達量, 這與本實驗結(jié)果一致。魚類和哺乳動物都缺乏Δ12和Δ15去飽和酶, 不能從頭合成LC-PUFA, 因此FAD2作為魚類LC-PUFA合成第一限速酶受到廣泛關注[35]。在飼料中添加CLA可調(diào)節(jié)魚類FAD2 mRNA表達, 然而即使是相同的魚類其規(guī)格不同, 研究結(jié)果也可能存在差異。Kennedy等[36]研究表明在均重87.5 g的大西洋鮭飼料中添加CLA可顯著提高其肝臟FAD2 mRNA表達量, 然而Leaver等[17]研究表明在均重為132 g大西洋鮭飼料中添加CLA對其肝臟FAD2 mRNA表達量無顯著影響。與前者研究結(jié)果相似,本研究結(jié)果顯示, 在草魚幼魚飼料中添加2%CLA可顯著提高其肝臟和肌肉FAD2 mRNA表達量, 促進了草魚組織LC-PUFA合成。在哺乳動物上的研究發(fā)現(xiàn), 用含1.5% CLA的日糧飼喂小鼠(Mus musculus) 21d后, 其組織FAD2 mRNA表達量也顯著上調(diào)[37]。

從體外攝入的脂質(zhì)經(jīng)消化道消化吸收后進入肝臟, 再和體內(nèi)合成的脂肪酸一起被脂蛋白轉(zhuǎn)運到機體各個組織分解供能或儲存, 而LPL可將載脂蛋白分解成脂肪酸和單酰甘油酯, 再通過脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白如CD36將細胞外的游離脂肪酸轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)分解供能或重新合成甘油三酯, 因此,LPL基因表達水平與機體營養(yǎng)狀況、激素水平和組織對脂肪酸需求相關[34]。Dong等[18]研究表明, 在草魚飼料中添加2.5% CLA可顯著上調(diào)肝臟和肌肉LPLmRNA表達, 推測飼料中添加2.5% CLA導致草魚通過增加脂肪酸β氧化將攝入的脂質(zhì)分解為機體供能而非儲存在組織內(nèi), 與之相對應, 2.5% CLA組草魚肝臟和肌肉脂肪含量顯著低于對照組。與上述實驗結(jié)果相似, 本研究結(jié)果表明, CLA1.5-CLA2.5組草魚肝臟和肌肉LPLmRNA表達量顯著高于對照組, 同樣可能是草魚攝入CLA后導致機體脂肪酸β氧化能力增強所致, 從而導致其顯著將肝臟和肌肉中脂肪積累。

轉(zhuǎn)運到組織分解供能的脂肪酸則需要β氧化相關的酶類參與其氧化分解過程, 而HSL是脂肪動員的主要限速酶, 與脂肪酸β氧化密切相關[38]。LaRosa等[39]研究發(fā)現(xiàn), 用含0.5%t10,c12 CLA日糧飼喂C57BL/6J小鼠3d后, 其脂肪組織HSL基因表達顯著高于對照組, 然而, 持續(xù)飼喂17d后,HSL基因表達又顯著下調(diào)。本實驗研究表明, CLA1.5-CLA2.5組中草魚肝臟和肌肉HSLmRNA表達顯著上調(diào)。與本實驗結(jié)果一致, Dong等[18]研究表明, 用在草魚飼料中添加2.5% CLA同樣可顯著上調(diào)肝臟和肌肉HSLmRNA表達。出現(xiàn)以上不同結(jié)果可能是種屬不同, 對CLA的生理效應不同導致的。脂肪代謝需要其代謝相關酶參與, 其基因表達受相應轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。目前研究表明, PPARα和PPARγ是脂肪代謝調(diào)節(jié)關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一, 前者與甘油三酯分解密切相關, 有研究表明PPARα是肝臟β氧化和微粒體ω氧化的主要調(diào)控者[40], 后者被配體活化后可增強存進脂肪酸儲存基因的表達, 如FATP (脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白)、CD36/FAT (CD36/脂肪酸異位蛋白酶)、脂肪酸結(jié)合蛋白等[41]。本實驗研究表明, CLA1.5-CLA2.5組草魚肝臟和肌肉PPARαmRNA表達量均顯著上調(diào), 肝臟PPARγmRNA表達顯著下調(diào)。Dong等[18]研究表明, 用2% CLA替代魚油可顯著上調(diào)肝臟和肌肉PPARαmRNA表達, 而PPARγmRNA顯著下調(diào)表達, 這與本實驗結(jié)果一致。同樣, 有研究表明, 在小鼠日糧中添加0.5%CLA可顯著提高其肝臟和肌肉PPARαmRNA的表達量[42]; 用1% CLA替代LA可顯著減低雄性ICR小鼠肝臟PPARγ1 mRNA的表達[43]。本研究表明, 在肌肉和肝臟的這6種基因表達量中, 均為ACC與CLA負相關最為顯著,HSL與CLA正相關最為顯著;這6種基因表達量之間,ACC與HSL負相關最為顯著,HSL與PPARα正相關最為顯著; 在肝臟中ACC與PPARγ正相關最為顯著,HSL與PPARγ負相關最為顯著, 而在肌肉中HSL與ACC負相關互為最為顯著。這表明在不同組織中, CLA對同一基因表達的影響并不一致, 在肝臟中, CLA可能主要調(diào)控PPARα、PPARγ、HSL和ACCmRNA表達量來調(diào)控脂質(zhì)代謝, 而在肌肉組織中, CLA可能主要調(diào)控PPARα、HSL和ACCmRNA表達量來調(diào)控脂質(zhì)代謝。由于CLA2組肝臟和肌肉中FAD2、LPL、HSL和PPARαmRNA上調(diào)表達最為顯著, 肝臟和肌肉ACCmRNA以及肝臟PPARγmRNA表達下調(diào)最為顯著, 因此, CLA2組為促進草魚肝臟和肌肉脂肪分解代謝相關基因mRNA表達, 而抑制脂肪合成相關基因表達的CLA適宜添加組。綜上所述, 結(jié)合2%CLA在不影響草魚的生長和飼料利用, 且顯著降低肝臟脂肪積累, 且CLA2組為可顯著提高草魚應對脅迫, 清除體內(nèi)過氧化應激產(chǎn)物的能力, 有利于魚體應對氧化應激, 減少機體損傷; 同時CLA2組也可促進草魚脂肪分解代謝相關基因mRNA表達,而抑制脂肪合成相關基因表達, 從而有助于減少草魚機體脂肪沉積, 降低脂肪肝形成的風險的CLA適宜添加組。

致謝:

感謝中國科學院武漢病毒研究所電鏡服務中心張配在電鏡樣品制作和圖片拍攝中提供的技術支持。