郭鑫偉 麥浩彬 遲淑艷, 譚北平, , 姚亞軍 姚紅梅 董曉慧, , 楊奇慧, 劉泓宇, 章 雙,

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室, 湛江 524088; 2. 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與高效飼料工程技術(shù)研究中心, 湛江524088; 3. 農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湛江 524088; 4. 長(zhǎng)沙興嘉生物工程有限公司, 長(zhǎng)沙 410128)

銅(Cu)作為動(dòng)物的必需微量元素在中各組織的生理生化學(xué)過(guò)程中承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能[1],例如銅作為超氧化物歧化酶的輔助因子, 參與清除自由基和電子傳遞一系列生物過(guò)程[2,3]; 作為細(xì)胞色素氧化酶、酪氨酸酶和抗壞血酸氧化酶的成分,影響體表色素形成和骨骼發(fā)育; 同時(shí), 銅還參與鐵的吸收及代謝, 影響機(jī)體健康[4]。

礦物元素可以與有機(jī)化合物如碳水化合物、氨基酸和水解蛋白質(zhì)(肽)等螯合, 使其可以在吸收位點(diǎn)以離子的形式釋放出去, 同時(shí)也能作為一種完整的螯合物被吸收, 能夠最大限度地減少與其他礦物元素的競(jìng)爭(zhēng)以及原料中植酸、粗纖維等物質(zhì)的螯合, 從而增強(qiáng)礦物元素的吸收。因而, 不同的銅源在魚體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸和代謝效率是存在差異的[5]。銅在飼料中最常見的添加形式是硫酸銅(CuSO4)[6-8]。與CuSO4相比, 魚類攝食堿式氯化銅和氨基酸螯合銅可以獲得更好的生長(zhǎng)[9-12]。并且,有機(jī)銅螯合物在水中的溶解度比CuSO4的溶解度低[11], 可以減少養(yǎng)殖水體污染。

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatus♂×Epinephelus fuscoguttatus♀)具有生長(zhǎng)快速、抗病力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)勢(shì)[13]。本研究通過(guò)在飼料中添加硫酸銅(CuSO4)、甘氨酸銅(Cu-Gly)和羥基蛋氨酸銅(Cu-HMA)三種銅源投喂珍珠龍膽石斑魚,評(píng)估飼料中銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能、抗氧化酶以及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響, 以期為石斑魚飼料中銅的添加形式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料配制

參考斜帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)[14,15]、點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)[11,16]銅需要量, 在飼料中分別添加CuSO4、Cu-Gly和Cu-HMA,在基礎(chǔ)飼料中銅的實(shí)際含量分別為5.45、5.94和5.53 mg/kg, 配制3組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料(表 1)。所有原料經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩, 與預(yù)混合的微量組分經(jīng)過(guò)V型立式混合機(jī)(浙江正泰電器股份有限公司,JS-14S型)進(jìn)行一次混合, 再與預(yù)混合的魚油和磷脂油于小型攪拌機(jī)(恒聯(lián)食品機(jī)械廠, B20-H型)中二次混合后經(jīng)雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué), F-75型)制成粒徑為3 mm的顆粒飼料。在室溫條件下自然風(fēng)干至水分含量為10%左右, 分裝封口, -20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)用魚及飼料管理

試驗(yàn)用珍珠龍膽幼魚(購(gòu)于湛江東海島石斑魚苗場(chǎng)), 暫養(yǎng)于東海島廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地室外水泥池, 投喂商品飼料馴化10d。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理組, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)珍珠龍膽石斑魚30尾, 養(yǎng)殖8周。每天飽食投喂2次(8:00和17:00)。

試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)沉淀、沙濾的天然海水, 試驗(yàn)期間每天換水1次, 換水量約為養(yǎng)殖水體的2/3, 養(yǎng)殖期間水溫(29.08±0.85)℃, 海水鹽度27—29, 水體溶解氧量≥5 mg/L, 氨氮含量≤0.03 mg/L, 水體銅的含量為1.32 μg/L。觀察石斑魚攝食情況, 記錄死亡數(shù)。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束, 禁飼24h后稱重, 記錄存活尾數(shù),計(jì)算成活率、增重率和特定生長(zhǎng)率。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚測(cè)體長(zhǎng)、體質(zhì)量后備測(cè)全魚常規(guī)養(yǎng)分以及全魚礦物質(zhì)含量; 另取5—7尾魚尾靜脈采血, 放入1.5 mL離心管中, 4℃靜置12h, 4000×g, 4℃離心10min, 分離上清液, 保存于-80℃超低溫冰箱, 用于測(cè)定血清生化指標(biāo)和血清酶活力; 解剖取肝臟稱重后迅速于液氮中, 后置于-80℃保存, 用于測(cè)定肝臟酶活力; 剝離脊椎骨-20℃保存, 用于測(cè)定脊椎骨礦物質(zhì)含量; 剝離取腸道置于10%甲醛溶液中固定,用于制作腸道組織學(xué)切片。

1.4 測(cè)定方法

常規(guī)養(yǎng)分試驗(yàn)飼料和全魚營(yíng)養(yǎng)成分均參照AOAC[17]的方法進(jìn)行測(cè)定: 水分含量采用105℃烘干恒重法測(cè)定, 粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(Kjeltec 8400 凱氏定氮儀)測(cè)定, 粗脂肪含量采用索式抽提法測(cè)定, 粗灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法測(cè)定。

生理生化、抗氧化酶血清總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi-7020型)進(jìn)行測(cè)定。

血清銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin, CP)活性、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

礦物元素含量準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)飼料、全魚、脊椎骨0.1—0.15 g置于消解罐中, 加入8 mL硝酸(Merck, 德國(guó))和2 mL雙氧水, 放入微波消解儀(CEM MARS)消解。在趕酸后轉(zhuǎn)入比色管中, 用超純水定容。采用等離子體質(zhì)譜儀(Thermo ICAP-6000 series)測(cè)定Cu、Fe、Mn、Zn四種元素含量。同時(shí)測(cè)定試驗(yàn)養(yǎng)殖水體中礦物質(zhì)含量。

腸道石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色的石蠟切片(武漢谷歌生物科技有限公司制作)在4倍全自動(dòng)生物顯微鏡(DM600)下觀察、拍照, 用體視顯微鏡(SZX7)測(cè)量皺襞高度(Plica height, PH), 皺襞寬度(Plica width, PW)和肌層厚度(Muscle thickness,MT), 每張切片分別隨機(jī)選擇10個(gè)位置測(cè)定相應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.5 計(jì)算方法

成活率(Survival rate,SR, %)=100%×Nt/N0;

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100%×(Wt-W0)/W0;

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100%×(lnWt-lnW0)/t;

飼料系數(shù)(Feed coversion ratio,FCR)=F/(Wt-W0);

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×;肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×Wh/Wt;臟體比(Viscerosomatic index,VSI)= 100×Wv/Wt。

式中:Nt為終末存活尾數(shù),N0為初始放養(yǎng)尾數(shù),Wt為終末體重(g),W0為初始體重(g),t為試驗(yàn)天數(shù)(d),F為飼料攝入量干重(g),Lt為終末體長(zhǎng)(cm),Wh為肝臟重量(g),Wv為內(nèi)臟團(tuán)重量(g)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,所有取得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素分析, 當(dāng)不同處理之間有顯著差異(P＜0.05)時(shí), 用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 珍珠龍膽石斑魚幼魚生長(zhǎng)性能

飼料中的銅源對(duì)珍珠龍膽的SR和FCR均無(wú)顯著影響(P＞0.05, 表 2)。Cu-Gly組和Cu-HMA組WGR、SGR顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。

由表 3所示, Cu-HMA組HSI、VSI顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05)。銅源各組間CF均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表 2 銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響Tab. 2 Effects of Cu sources on growth performance of juvenile pearl gentian grouper

2.2 珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚體成分和脊椎骨礦物元素含量

在飼料中添加3種銅源顯著影響全魚水分以及粗脂肪含量(P＜0.05, 表 4)。CuSO4組和Cu-Gly組全魚水分無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05); Cu-HMA組粗脂肪含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。

Cu-Gly組和Cu-HMA組全魚鐵含量無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于CuSO4組(P＜0.05);CuSO4組全魚鋅含量顯著低于Cu-Gly組(P＜0.05),Cu-HMA組與其他兩組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05);全魚銅、錳含量不受飼料銅源的影響, 各組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05, 表 5)。

Cu-HMA組脊椎骨銅和鋅含量顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-Gly組脊椎骨銅、鋅含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05); Cu-Gly組脊椎骨鐵含量顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-HMA組脊椎骨鐵含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05); Cu-Gly組和Cu-HMA組脊椎骨錳含量無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于CuSO4組(P＜0.05, 表 6)。

珍珠龍膽石斑魚幼魚養(yǎng)殖水體中, 礦物質(zhì)銅、鐵、錳、鋅四種元素含量較低。各組間銅、鐵、錳、鋅含量均無(wú)顯著差異(P＜0.05, 表 7)。

2.3 珍珠龍膽石斑魚幼魚血清生化指標(biāo)和肝臟抗氧化酶活性

CuSO4組血清TG和LDLC顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05), Cu-Gly組和Cu-HMA組相比TG和LDLC無(wú)顯著差異(P＞0.05)。CuSO4組血清HDLC顯著低于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05),Cu-Gly組和Cu-HMA組相比HDLC無(wú)顯著差異(P＞0.05)。CuSO4組血清CP含量顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05), Cu-Gly組血清CP活性顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05, 表 8)。

表 3 銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Tab. 3 Effects of Cu sources on morphological characteristics of juvenile pearl gentian grouper

表 4 珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚體成分分析Tab. 4 Analysis of Cu sources on whole body compositions of juvenile pearl gentian grouper

表 5 銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚銅、鐵、錳、鋅含量的影響Tab. 5 Effects of Cu sources on Cu, Fe, Mn and Zn contents in whole fish body

表 6 銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚脊椎骨銅、鐵、錳、鋅含量的影響Tab. 6 Effects of Cu sources on Cu, Fe, Mn and Zn contents in vertebrae of juvenile pearl gentian grouper

表 7 珍珠龍膽石斑魚幼魚養(yǎng)殖水體銅、鐵、錳、鋅含量Tab. 7 Cu, Fe, Mn and Zn content in mariculture water of juvenile pearl gentian grouper

表 8 珍珠龍膽石斑魚幼魚血清生化指標(biāo)分析Tab. 8 Analysis of Cu sources on serum biochemical indices of juvenile pearl gentian grouper

飼料未顯著影響肝臟MDA、T-SOD和CuZn-SOD活性(P＞0.05, 表 9)。

2.4 珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

由表 10所示, Cu-HMA組前腸、中腸和后腸PH顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-Gly組中腸和后腸PH顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。Cu-Gly組前腸和后腸PW顯著高于CuSO4組和Cu-HMA組(P＜0.05), CuSO4組前腸和后腸PW顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05); CuSO4組中腸PW顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05)。在飼料中添加3種銅源對(duì)中腸MT未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05), Cu-Gly組前腸和后腸MT顯著高于CuSO4組和Cu-HMA組(P＜0.05), CuSO4組前腸和后腸MT顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05)。腸道切片顯示, Cu-Gly組和Cu-HMA組杯狀細(xì)胞顯著多于CuSO4組(圖1—3)。

3 討論

3.1 飼料銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

不同形式的銅源在分子結(jié)構(gòu)、分子量、溶解度、吸收方式以及飼料中的干擾物質(zhì)等方面均存在差異[18,19]。無(wú)機(jī)銅易與飼料中的植酸和粗纖維絡(luò)合成沉淀而影響銅的吸收, 而氨基酸銅可以氨基酸或肽的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑通過(guò)小腸絨毛刷狀緣被吸收[19],因此, 無(wú)機(jī)銅的吸收利用程度低于氨基酸螯合銅[20]。喬永剛[21]研究發(fā)現(xiàn)以WGR和SGR為評(píng)價(jià)指標(biāo), 軍曹魚(Rachycentron canadum)對(duì)蛋氨酸銅的生物利用率是CuSO4的1.53倍和1.8倍。氨基酸銅比無(wú)機(jī)銅能更有效地能促進(jìn)點(diǎn)帶石斑魚[11]、吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)[22]、俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedtii)[23]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[24]、花鱸(Lateolabrax japonicus)[25]等魚類的生長(zhǎng), 在本試驗(yàn)中Cu-Gly組和Cu-HMA組WGR、SGR顯著高于CuSO4組也印證了這一點(diǎn)。然而, 在飼料中添加氨基酸銅和CuSO4并未對(duì)異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[26]和花鱸[25]WGR和SGR產(chǎn)生顯著影響,可能與飼料組成、魚體對(duì)銅源的耐受量等因素有關(guān)。

軍曹魚[21]、俄羅斯鱘[23]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[27]攝食含氨基酸銅的飼料, 其骨骼中銅的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織中銅的含量, 表明骨骼對(duì)銅具有較強(qiáng)的累積作用。珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚銅含量不受添加銅源的影響, 但是脊椎骨中銅的含量以氨基酸螯合銅組(Cu-HMA組和Cu-Gly組)最高。礦物質(zhì)的交互作用可能表現(xiàn)為對(duì)于腸道吸收或運(yùn)輸結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、酶活性位點(diǎn)的替代或礦物質(zhì)正常代謝過(guò)程中的相互促進(jìn)。Cu-Gly組和Cu-HMA組全魚、脊椎骨鋅、鐵含量顯著高于CuSO4組, 說(shuō)明氨基酸銅在吸收方面不僅避免了其他礦物元素的競(jìng)爭(zhēng), 還能有效提高鋅和鐵的沉積。

銅作為參與機(jī)體代謝眾多酶的輔助因子, 能顯著影響哺乳動(dòng)物的脂肪沉積[22]。飼料中不同銅源對(duì)閹牛血清CHOL、TG、HDLC和LDLC均無(wú)顯著影響無(wú)顯著影響, 但是攝食無(wú)銅組飼料的閹牛血清HDLC和LDLC均顯著高于銅源組[28]。賴氨酸銅比五水硫酸銅更有效地降低北京鴨血漿TG[29]。在本實(shí)驗(yàn)中, 飼料中銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清CHOL未產(chǎn)生顯著影響, 氨基酸銅可顯著降低石斑魚血清TG和LDLC含量, 提高血清HDLC含量, 提示氨基酸銅有利于TG轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織參與能量代謝或者進(jìn)入脂肪組織儲(chǔ)存。在本實(shí)驗(yàn)中攝食Cu-HMA的石斑魚全魚粗脂肪含量顯著高于CuSO4組, 也表明飼料中不同銅源會(huì)影響魚體脂肪的含量。

表 9 銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響Tab. 9 Effects of Cu sources on liver autioxidant enzyme activities of juvenile pearl gentian grouper

3.2 三種銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚抗氧化酶指標(biāo)的影響

圖 1 銅源對(duì)珍珠龍膽幼魚前腸發(fā)育的影響(HE染色, 10×)Fig. 1 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the foregut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)雙向箭頭. 肌層厚度; 弧形箭頭. 皺襞寬; 曲線雙向箭頭. 皺襞高; 單向箭頭. 杯狀細(xì)胞; a. CuSO4組; b. Cu-Gly組; c. Cu-MHA組Double-headed arrow: muscle thickness; Cambered arrow: plica width; Double-headed curved arrow: plica height; Single-headed arrow:goblet cell; a. CuSO4 group; b. Cu-Gly group; c. Cu-MHA group

圖 2 三種銅源對(duì)珍珠龍膽幼魚中腸發(fā)育的影響(HE染色, 10×)Fig. 2 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the midgut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)

CP是動(dòng)物體內(nèi)的一種含銅的糖蛋白, 可調(diào)節(jié)銅在組織中的分布, 調(diào)節(jié)機(jī)體組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物如MDA及自由基的產(chǎn)生[9,30], 還參與銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的組成, 參與機(jī)體抗氧化。Shao等[9]得出異育銀鯽血漿T-SOD和CuZn-SOD活性不受飼料銅源的影響。同樣, 在本實(shí)驗(yàn)中石斑魚肝臟T-SOD和CuZn-SOD活性亦不受銅源的影響。然而, 相比于CuSO4或堿式氯化銅, 異育銀鯽[9]和俄羅斯鱘幼魚[23]攝食氨基酸螯合銅可獲得較高的血漿CP活性和肝臟CuZn-SOD活性, 同時(shí)MDA含量較低, 具有更好的抗氧化作用。在飼料中分別添加4.54和6.34 mg/kg的蛋氨酸銅和CuSO4對(duì)俄羅斯鱘具有相同的抗氧化效果[23]。但是, 本實(shí)驗(yàn)CuSO4組血清CP活性顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組, 飼料不同的銅源對(duì)石斑魚肝臟SOD活性和MDA含量沒有顯著影響。

圖 3 三種銅源對(duì)珍珠龍膽幼魚后腸發(fā)育的影響(HE染色, 10×)Fig. 3 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the hindgut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)

3.3 三種銅源對(duì)珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態(tài)的影響

腸道作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場(chǎng)所, 其良好的生長(zhǎng)發(fā)育是養(yǎng)分被充分消化、吸收和利用的基本保障[31,32]。魚類腸黏膜PH是腸道吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力的標(biāo)志[33], MT的增加可以提高小腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表面積, 改善腸道消化和吸收能力[34—37]。銅在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)主要通過(guò)腸道吸收來(lái)調(diào)節(jié)[38], 而魚類對(duì)飼料銅的吸收主要發(fā)生在幽門、中腸和后腸[26]。不同來(lái)源的銅對(duì)腸道的發(fā)育影響不同, 相對(duì)于CuSO4組, Cu-Gly可改善小鼠腸道絨毛長(zhǎng)度和絨毛厚度[38]; 蛋白螯合銅組生長(zhǎng)肥育豬十二指腸、空腸上皮細(xì)胞絨毛高度、絨毛寬度有升高趨勢(shì)[39]; 載銅蒙脫石顯著提高了羅非魚前腸、中腸、后腸絨毛和微絨毛高度[40]。在本實(shí)驗(yàn)中Cu-HMA和Cu-Gly能提高珍珠龍膽石斑魚中、后腸的PH、MT和PW, 表明氨基酸銅對(duì)腸道PH、PW和MT有積極的改善作用, 從而提高魚類的生長(zhǎng)和飼料利用率。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下, 在飼料中添加Cu-Gly和Cu-HMA能顯著影響珍珠龍膽石斑魚幼魚的生長(zhǎng)及血清脂質(zhì)代謝。銅源不影響全魚銅的沉積, 而Cu-Gly和Cu-HMA則有利于脊柱骨銅的沉積, 且后者的作用效果更好。銅源顯著影響中、后腸皺襞高度, 有利于腸道的消化吸收。