楊英豪 李學(xué)山 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 艾慶輝

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003)

隨著集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展, 尋找優(yōu)質(zhì)蛋白源以替代魚(yú)粉(Fish meal, FM)、節(jié)約成本, 成為水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1—5]。研究發(fā)現(xiàn), 不同蛋白源具有不同的特點(diǎn), 大豆?jié)饪s蛋白(Soy protein concentrate, SPC)由于蛋白質(zhì)含量高(65%—70%的粗蛋白), 抗?fàn)I養(yǎng)因子和纖維含量較低, 同時(shí)還具有利用率高、氨基酸平衡性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn), 成為極具潛力的魚(yú)粉替代源[6,7]。在線鱧(Channa striata)[8]和星斑川鰈(Platichthys stellatusPallas)[9]中研究發(fā)現(xiàn), 用SPC替代部分魚(yú)粉可顯著提高魚(yú)體生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化效率。水解魚(yú)肉蛋白(Fish hydrolysate, FH)是一種富含各種肽段、誘食好且促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)明顯的蛋白源[10,11]。在大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)的養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn), 用過(guò)濾后的水解蛋白替代40%的魚(yú)粉, 相比于全魚(yú)粉組, 不影響大黃魚(yú)的存活率和特定生長(zhǎng)率[12]。晶體氨基酸(Crystal amino acids, CAA)可被魚(yú)體直接吸收和利用, 因此晶體氨基酸對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物來(lái)說(shuō)也是極具價(jià)值的魚(yú)粉替代源[13—15]。然而, 這幾種蛋白源在同一魚(yú)類(lèi)中的替代效果尚不明確, 有待進(jìn)一步研究。

日糧蛋白和內(nèi)源性蛋白經(jīng)胰蛋白酶、小腸刷狀緣蛋白酶和肽酶等消化后形成小肽和游離氨基酸, 經(jīng)小腸吸收后進(jìn)入血液循環(huán), 被機(jī)體各組織器官吸收利用[16]。消化后的氨基酸和小肽主要由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PEPT1)進(jìn)行吸收[17]。機(jī)體吸收的小肽和氨基酸一方面可用于分解供能,另一方面可用來(lái)重新合成蛋白質(zhì), 蛋白質(zhì)在機(jī)體的沉積是由蛋白質(zhì)的分解和合成共同決定的[18,19], 其中雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號(hào)通路對(duì)于蛋白質(zhì)的合成起著至關(guān)重要的作用。哺乳動(dòng)物中關(guān)于不同蛋白源調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的研究已較為系統(tǒng)[20,21], 然而魚(yú)類(lèi)中關(guān)于不同蛋白源對(duì)PEPT1和TOR基因表達(dá)的調(diào)控及魚(yú)體生長(zhǎng)的影響還有待進(jìn)一步研究。

瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachelli), 鯰形目、鲿科、黃顙魚(yú)屬, 溫水性魚(yú)類(lèi), 我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類(lèi)之一。近年來(lái), 隨著瓦氏黃顙魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大, 對(duì)魚(yú)粉的需求量也隨之增加, 飼料成本逐漸加大, 因此亟待尋找合適的蛋白源替代魚(yú)粉以促進(jìn)瓦氏黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[22]。本研究旨在比較不同蛋白源對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)、體組成和蛋白質(zhì)代謝基因PEPT1和TOR表達(dá)的影響, 以探討不同蛋白源對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)性狀的影響機(jī)理, 為黃顙魚(yú)飼料中魚(yú)粉替代提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 飼料配方和飼料制作

表 1 實(shí)驗(yàn)飼料配方和化學(xué)成分(%干重)Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

分別以魚(yú)粉(FM)、大豆?jié)饪s蛋白(SPC)、水解魚(yú)蛋白(FH)和晶體氨基酸混合物(CAA)為主要蛋白源, 魚(yú)油、豆油和大豆卵磷脂為主要脂肪源, 小麥粉為糖源制作4種等氮(粗蛋白含量為39.0%)等脂(粗脂肪含量為9.0%)的實(shí)驗(yàn)飼料(表 1)。FH購(gòu)自上海海清飼料公司, 其他飼料原料購(gòu)自青島七好生物科技有限公司。

飼料制作前, 將飼料原料進(jìn)行粉碎并過(guò)246目篩。在飼料制作過(guò)程中, 飼料原料根據(jù)配方按逐級(jí)放大原理混合均勻, 之后加入魚(yú)油、豆油和卵磷脂,手工將油脂顆粒搓勻, 然后加入適量水, 用全自動(dòng)漁用餌料機(jī)(F-26(Ⅱ), 華南理工大學(xué))進(jìn)行制粒, 制成直徑為1.5 mm×3.0 mm飼料顆粒, 以45℃烘至水分含量小于10%, 用雙層塑料袋扎口保存, 置-20℃冰箱中備用。

1.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)和樣品采集

瓦氏黃顙魚(yú)購(gòu)于四川眉山育苗場(chǎng), 實(shí)驗(yàn)前, 實(shí)驗(yàn)魚(yú)在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周, 以FM組飼料進(jìn)行飽食投喂, 使實(shí)驗(yàn)魚(yú)逐漸適應(yīng)人工飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 黃顙魚(yú)饑餓24h, 將初重(2.90±0.01) g的瓦氏黃顙魚(yú)隨機(jī)分成4組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)(桶/260 L)60尾魚(yú)。每天人工飽食投喂2次(7: 00和 18: 00), 在投喂結(jié)束后1h, 吸出殘餌在70℃烘箱中烘干至恒重, 并稱(chēng)重, 每天記錄投餌量。養(yǎng)殖周期 66d, 養(yǎng)殖期間記錄每桶的死魚(yú)數(shù)量并稱(chēng)重。實(shí)驗(yàn)條件: 水溫,25—26℃; 溶氧, ＞6.0 mg/L; pH, 6.8—7.6; 總氨氮量, ＜0.1 mg/L; 亞硝酸鹽, ＜0.1 mg/L; 所有養(yǎng)殖桶均連續(xù)充氣, 光照為自然光照。

養(yǎng)殖中期(35d)和養(yǎng)殖末期(66d)采集樣品。取樣前, 將魚(yú)體饑餓24h, 統(tǒng)計(jì)每桶瓦氏黃顙魚(yú)數(shù)量和重量, 每桶隨機(jī)挑選10尾魚(yú), 用MS-222麻醉(1∶10000; 上?？低∩锟萍加邢薰? 中國(guó)), 采集魚(yú)體前腸和肝臟組織, 立即置于液氮, 待樣本采集完畢后統(tǒng)一放于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存, 用于后續(xù)代謝基因的定量分析。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诿客傲砣?尾黃顙魚(yú),于-20℃冰箱保存, 用于后續(xù)體組成分析。

1.3 化學(xué)分析

采用AOAC (1995)[23]標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)飼料原料、飼料和魚(yú)體成分進(jìn)行分析; 采用全自動(dòng)凱氏定氮儀(Kjeltec 2300, Sweden)測(cè)定粗蛋白含量(N×6.25); 采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量(Buchi 36680, Switzerland); 樣品于電爐上炭化后, 馬弗爐中(550℃)灼燒12h, 可得樣品灰分含量。

1.4 RNA 提取

將黃顙魚(yú)肝臟和前腸在液氮中磨成粉末, 然后放入含1 mL Trizol的無(wú)RNase離心管中, 分別加入氯仿、異丙醇、乙醇等試劑, 最后用滅菌水溶解沉淀, 具體操作過(guò)程參照李明珠[24]方法。RNA質(zhì)量通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 濃度通過(guò)核酸定量?jī)x(Nano Drop 2000 spectrophotometer, Thermo, USA)測(cè)定。將各組織樣品的RNA調(diào)成1 μg后, 用Primer-Script?Reverse Transcriptase (TaKaRa, Japan)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA, 具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR?Green I嵌合熒光法, 使用SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect Real Time, TaKaRa, Japan)試劑在Thermal cycler (Mastercycler ep realplex, Eppendorf, German)儀器上進(jìn)行, 反應(yīng)條件為: 95℃2min, 1循環(huán); 95℃變性15s, 59℃退火15s, 72℃延伸30s, 共計(jì)40個(gè)循環(huán)。溶解曲線: 95℃, 15s; 59℃,15s, 95℃, 5min。以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因。在定量前, 驗(yàn)證內(nèi)參基因、PEPT1和TOR2基因引物(表 2)的擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)PEPT1、TOR、GAPDH和β-actin基因的擴(kuò)增效率分別為0.98、0.95、0.99和0.98, 隨后以Lg(模板相對(duì)拷貝數(shù))為橫坐標(biāo), 以平均ΔCt(目的基因Ct值)-平均ΔCt(目的內(nèi)參-內(nèi)參基因Ct值后再平均)為縱坐標(biāo), 得到另外一條直線, 若其斜率絕對(duì)值小于0.1, 即說(shuō)明目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致, 用2-ΔΔCt進(jìn)行基因表達(dá)分析[25]。分別對(duì)中期、末期瓦氏黃顙魚(yú)PEPT1和TOR基因進(jìn)行RT-PCR分析, 以水解魚(yú)肉蛋白組為對(duì)照組, 對(duì)其他組的基因表達(dá)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算如下:

成活率(SR, %)=100%×(末魚(yú)數(shù)量/初魚(yú)數(shù)量)特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)=100%×[(Ln終末重-Ln初始重)/實(shí)驗(yàn)天數(shù)]

結(jié)果采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 在單因素方差分析(ANOVA)數(shù)據(jù)達(dá)到顯著(P＜0.05)時(shí), 進(jìn)行Tukey’s多重比較, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)不同生長(zhǎng)階段存活率和生長(zhǎng)的影響

各處理組瓦氏黃顙魚(yú)存活率(SR)無(wú)顯著差異(P＞0.05), 且SR均大于94%。在生長(zhǎng)方面, 不同蛋白源顯著影響瓦氏黃顙魚(yú)生長(zhǎng)性能(P＜0.05)。在第35和第66天時(shí), FM組瓦氏黃顙魚(yú)SGR分別為4.86%/d和3.08%/d, SPC組瓦氏黃顙魚(yú)SGR分別為3.94%/d和2.55%/d, SPC組瓦氏黃顙魚(yú)SGR雖然低于FM組,但顯著高于FH組(1.13%/d和0.96%/d)和CAA組(1.69%/d和1.28%/d) (表 3)。

表 2 瓦氏黃顙魚(yú)PEPT1和TOR2基因定量所需引物序列Tab. 2 Real-time quantitative PCR primers for PEPT1 and TOR2 genes

表 3 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)不同生長(zhǎng)階段存活率和生長(zhǎng)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 3 Growth performance and survival of darkbarbel catfish (Pelteobagrus vachelli) fed diets at different growth stages (Mean±SEM, n=3)

2.2 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)體組成的影響

不同蛋白源顯著影響了瓦氏黃顙魚(yú)體組成。SPC替代FM會(huì)降低魚(yú)體粗蛋白含量, SPC組魚(yú)體蛋白含量?jī)H次于FM組, 其粗蛋白含量為13.28%。SPC組瓦氏黃顙魚(yú)的粗脂肪含量顯著高于FM組(P＜0.05), 粗脂肪含量為 14.86%, SPC組瓦氏黃顙魚(yú)灰分和水分含量顯著低于其他組(P＜0.05), 分別為6.80%和69.48% (表 4)。

表 4 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)體組成的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3, 濕重%)Tab. 4 Body composition analysis of darkbarbel catfish (Pelteobagrus vachelli) fed diets at different growth stages (Mean±SEM, n=3, wet weight %)

2.3 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)前腸PEPT1和肝臟TOR基因表達(dá)的影響

在第35和第66天時(shí), 不同蛋白源顯著影響了瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)前腸PEPT1的表達(dá)(P＜0.05, 圖 1)。在第35天時(shí), FM組魚(yú)體前腸PEPT1基因表達(dá)量顯著高于其他處理組(P＜0.05), SPC組魚(yú)體前腸PEPT1表達(dá)量顯著高于FH和CAA組(P＜0.05)。在第66天時(shí),SPC組魚(yú)體前腸PEPT1表達(dá)量顯著高于FM組(P＜0.05)。在第35和第66天時(shí), 不同蛋白源并未顯著影響瓦氏黃顙魚(yú)肝臟TOR基因的表達(dá)水平(P＞0.05,圖 2)。

3 討論

3.1 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)不同生長(zhǎng)階段存活率和生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)存活率無(wú)顯著影響, 說(shuō)明瓦氏黃顙魚(yú)對(duì)養(yǎng)殖條件和實(shí)驗(yàn)飼料較為適應(yīng)。在第35和第66天時(shí), FM組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)性能達(dá)到最大, 顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組; 通過(guò)比較瓦氏黃顙魚(yú)SGR發(fā)現(xiàn), SPC組雖然低于FM組, 但顯著高于FH組和CAA組, 說(shuō)明SPC是較理想的魚(yú)粉替代源。SPC組的瓦氏黃顙魚(yú)具有相對(duì)較好的生長(zhǎng)性狀, 這可能和SPC的特性相關(guān), SPC蛋白含量高達(dá)65%—70%, 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低, 同時(shí)SPC具有利用率高等特點(diǎn)[26], 因此, 使用SPC飼喂魚(yú)體能使魚(yú)體獲得較好的生長(zhǎng)性能。在大黃魚(yú)[27]、真鯛(Pagrus major)[28]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[29]中使用SPC進(jìn)行投喂, 魚(yú)體均具有較高的SGR。但是SPC缺乏魚(yú)體生長(zhǎng)所需的蛋氨酸, 因此本實(shí)驗(yàn)SPC的替代效果稍差于魚(yú)粉, 這可能與SPC中缺乏蛋氨酸有關(guān)[30,31]。

3.2 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)體組成的影響

蛋白源會(huì)影響魚(yú)體組成, 在本實(shí)驗(yàn)中魚(yú)粉組瓦氏黃顙魚(yú)的粗蛋白含量顯著高于其他組。這可能與魚(yú)粉具有較高的氨基酸平衡性有關(guān)[32—34], 魚(yú)粉水解出的氨基酸更有利于魚(yú)體蛋白沉積, 而這一點(diǎn)在其他實(shí)驗(yàn)中也得到類(lèi)似的結(jié)果。周暉等[35]用酵母粉、脫脂豆粕和玉米蛋白粉分別替代10%的魚(yú)粉,飼喂體重30—38 g的軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum)幼魚(yú)5周, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)FM組軍曹魚(yú)體蛋白含量最高。李學(xué)麗等[36]用2種豆粕部分替代魚(yú)粉, 發(fā)現(xiàn)魚(yú)粉組珍珠龍膽石斑魚(yú)(Epinephelus fuscoguttatus×Epinephelus lanceolatus)幼魚(yú)的全魚(yú)體蛋白含量顯著高于其他組。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn), SPC組瓦氏黃顙魚(yú)的體脂含量達(dá)到最大。與其他魚(yú)粉替代源相比, SPC含有較少的抗?fàn)I養(yǎng)因子, 雖然其氨基酸平衡性稍差于魚(yú)粉, 但仍?xún)?yōu)于其他植物蛋白源, 有利于蛋白或糖類(lèi)等轉(zhuǎn)化為脂肪儲(chǔ)存。SPC的這種特性在其他研究中也得到驗(yàn)證, Kissinger等[37]以SPC和其他蛋白源替代魚(yú)粉飼喂長(zhǎng)鰭(Seriola rivoliana) 9周, 發(fā)現(xiàn)其他組魚(yú)體粗脂肪含量顯著低于80%SPC組。

圖 1 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)前腸PEPT1 mRNA表達(dá)的影響Fig. 1 Effects of different dietary protein sources on PEPT1 mRNA expressions in the foregut of darkbarbel catfish圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3), 含有相同字母或沒(méi)有上標(biāo)代表差異不顯著(P≥0.05); 下同Data are presented as means±SEM (n=3). Means in each bar sharing the same superscript letter or absence of superscripts are not significantly different determined by Tukey's test (P≥0.05),the same applies below

圖 2 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)肝臟TOR mRNA表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of different dietary protein sources on TOR mRNA expressions in the liver of darkbarbel catfish

3.3 不同蛋白源對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)幼魚(yú)前腸PEPT1和肝臟TOR基因表達(dá)的影響

不同蛋白源會(huì)顯著影響魚(yú)體蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá), 對(duì)虹鱒[38]飼喂含小肽、游離氨基酸和完整蛋白質(zhì)的飼料會(huì)顯著影響虹鱒腸道PEPT1的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中, 第35天和第66天時(shí), FM組和SPC組黃顙魚(yú)前腸PEPT1的表達(dá)高于其他組。相比于CAA、SPC和FM可被魚(yú)體腸道蛋白酶水解為小肽, 可提高PEPT1 mRNA的表達(dá), 促進(jìn)魚(yú)體對(duì)蛋白的吸收, 從而增加魚(yú)體的蛋白沉積, 有利于魚(yú)體生長(zhǎng), 這表明SPC是較好的FM替代源。在33d和66d時(shí), FH組魚(yú)體PEPT1 mRNA表達(dá)量最低, 在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[39]上也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果。然而, 在大西洋鮭(Salmo salarL.)[40]、鯉(Cyprinus carpioL.)[41]和黃金鱸(Perca flavescens)[42]的相關(guān)研究中卻得到不同的結(jié)果, 這很可能是由于魚(yú)種、水解底物等不同所引起的。

PEPT1的表達(dá)還和生長(zhǎng)階段、能量水平等因素有關(guān)。在早期發(fā)育階段, 鱖(Siniperca chuatsi)[43]腸道PEPT1表達(dá)量較高, 而隨著魚(yú)體體重的進(jìn)一步增加, 腸道PEPT1的表達(dá)量逐漸下降并趨于穩(wěn)定。在能量影響PEPT1的研究中, 高能量(13.17 kJ/kg)組肉雞空腸和回腸PEPT1表達(dá)量顯著低于低能量組(12.34 kJ/kg)[44]。在本實(shí)驗(yàn)中, 在33d時(shí)FM組魚(yú)體PEPT1表達(dá)量較高, 而66d時(shí)FM組魚(yú)體PEPT1表達(dá)量出現(xiàn)一定程度下降。這可能是FM相比于CAA和FH, FM能量更高,PEPT1表達(dá)上升有利于黃顙魚(yú)吸收能量物質(zhì), 用于生長(zhǎng), 而隨著黃顙魚(yú)體重進(jìn)一步增加,PEPT1表達(dá)出現(xiàn)一定程度地下降。

綜上所述, SPC的替代效果盡管差于FM, 但顯著優(yōu)于FH和CAA, 這可能是由于SPC上調(diào)前腸PEPT1的表達(dá)、促進(jìn)魚(yú)體對(duì)小肽的吸收所致, 表明SPC可作為一種魚(yú)粉替代的優(yōu)質(zhì)蛋白源。