劉勝帥,張 俊,戴莉萍,2,萬 蘋,3,耿福能,4,沈詠梅,4,張成桂,劉 衡

(1.大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,藥用特種昆蟲開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,中國(guó)西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,云南 大理 671000;2.大理白族自治州人民醫(yī)院病理科,云南 大理 671000;3.云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科,云南 昆明 650032;4.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610000)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病中的一種,臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液膿血便,其發(fā)病機(jī)制尚未清楚,屬中醫(yī)的“泄瀉”“久痢”“便血”等范疇[1]。研究表明,UC的發(fā)病與免疫、遺傳、環(huán)境、感染等因素密切相關(guān),目前臨床治療UC的藥物主要有5-氨基水楊酸類、腎上腺皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類等[2-3],但尚未有特效的治療方案和藥物,且長(zhǎng)期使用上述藥物后不良反應(yīng)較多,給患者帶來更多痛苦,因此尋找治療UC的有效藥物顯得尤為重要。隨著中藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的臨床報(bào)道越來越多,中藥以療效好、毒副作用小[4]的優(yōu)勢(shì)創(chuàng)造了中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥治療UC的契機(jī),也為抗UC新藥提供了新的研究熱點(diǎn)。

美洲大蠊(Periplaneta americanaL.)俗稱蟑螂,入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[5],其在云南民間已有悠久的入藥歷史。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),美洲大蠊具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、護(hù)肝、抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、組織修復(fù)等作用[6]。經(jīng)過多年的臨床使用,發(fā)現(xiàn)康復(fù)新液不僅對(duì)體表創(chuàng)傷有效,還能治療胃及十二指腸潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎等多種頑固性消化道疾病[7]。本項(xiàng)目組成員前期研究發(fā)現(xiàn),康復(fù)新液能有效緩解噁唑酮和2,4-二硝基氯苯誘導(dǎo)的UC大鼠的炎癥程度[8]。本實(shí)驗(yàn)采用家兔結(jié)腸抗原致敏聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)SD大鼠UC模型,考察康復(fù)新液對(duì)慢性免疫型UC的療效及作用機(jī)制,為康復(fù)新液用于UC臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 將市售康復(fù)新液干燥成黏稠狀浸膏,用生理鹽水(NS)配成含稠膏167 g/L的高劑量溶液;再將高劑量溶液依次用NS等倍稀釋成康復(fù)新中、低劑量溶液。柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信宜天平藥業(yè)有限公司)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只,體重180～220 g,購(gòu)自四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030,批號(hào)：20160725;健康家兔20只,雌雄不拘,體重3.0～3.5 kg,大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC系統(tǒng)(18℃,50%RH)適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑及儀器 隱血試劑盒、大鼠IL-17 ELISA試劑盒、大鼠EGF ELISA試劑盒、大鼠MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所);大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-8 ELISA試劑盒(購(gòu)自欣博盛QuantiCyto?生物科技有限公司);201酶標(biāo)儀(購(gòu)自?shī)W地利安圖斯公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 隨機(jī)選取50只大鼠,參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]和文獻(xiàn)方法[10]-[12],制備家兔抗原內(nèi)容物凍干粉作為抗原,并加以改進(jìn)實(shí)現(xiàn)模型建立。精密稱取家兔結(jié)腸凍干粉520 mg,用2.75 mL NS溶解,待完全溶解后,取2.75 mL完全弗氏佐劑,渦旋混勻制備成抗原乳化液,分別于第1、8、15、22、29 d在大鼠左側(cè)足跖、右側(cè)足趾、腹股溝、背部皮下及腹腔注射抗原乳化液0.1 mL,現(xiàn)配現(xiàn)用;大鼠末次注射抗原乳化液后(末次注射不加佐劑),禁食不禁水24 h,異氟烷麻醉,聚乙烯導(dǎo)管插入大鼠肛門約8 cm處,緩慢注入5%醋酸水溶液1.0 mL,滯留15 s,4 mL NS沖洗干凈,然后給予抗原(不含完全弗氏佐劑)溶液1.0 mL(含抗原8 mg),30 min后再用4 mL NS沖洗,造模完成。剩余10只大鼠為正常對(duì)照,按上述方法平行操作,用NS替代造模試劑。

1.4.2 分組及給藥 將造模大鼠隨機(jī)分為5組：模型對(duì)照組,SASP組(300 mg/kg·bw)(陽性藥對(duì)照組),康復(fù)新液高劑量組(2.5 g/kg·bw)、中劑量組(1.25 g/kg·bw)、低劑量組(0.625 g/kg·bw),每組10只。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予NS,其余各組灌腸給予相應(yīng)體積的藥物,各組于造模后第1天開始灌腸給藥,連續(xù)14 d,并于給藥第1、4 、7 、10 、14天參照 Hamamoto[13]對(duì)大鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index,DAI)評(píng)分。末次給藥后,禁食不禁水24 h,用10%水合氯醛溶液(3.0 mL/kg·bw)麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,離心取上層血清,按試劑盒說明書檢測(cè)IL-8、IL-17的含量;取肝臟、脾臟、胸腺稱重,計(jì)算臟器指數(shù);沿腸系膜緣剪開腸腔,清洗后取結(jié)腸稱濕重,參照Ekstr?m G M等[14]和Luk等[15]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(Colonmucosa damage index,CMDI)評(píng)分,切取病變嚴(yán)重結(jié)腸組織勻漿,離心后取上清液,按試劑盒說明書檢測(cè)EGF、MPO、TNF-α含量。剩余結(jié)腸制作病理切片,參照Ekstr?m G M等[14]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分(Histopathological score,HS)。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行檢驗(yàn),各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“±s”表示,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用方差檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),采用秩和檢驗(yàn),以P＜0.05或P＜0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠DAI評(píng)分的影響 造模后第1天,UC模型大鼠出現(xiàn)不同程度的厭食、懶動(dòng)、體重下降、腹瀉、血便等現(xiàn)象,DAI評(píng)分顯著升高,提示模型成功,且給藥期間模型穩(wěn)定;隨著治療時(shí)間延長(zhǎng),各給藥治療組大鼠的DAI評(píng)分逐漸降低,造模后第14天,與模型對(duì)照組比較,各給藥治療組大鼠DAI評(píng)分顯著降低,結(jié)果見表1。

表1 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠DAI評(píng)分的影響(±s,n=10)

表1 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠DAI評(píng)分的影響(±s,n=10)

注：與正常對(duì)照組比較,?P＜0.05,??P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較,△P ＜0.05,△△P ＜0.01;與 SASP組比較,▲P ＜0.05,▲▲P ＜0.01,下表同及下圖同

組別________________________________________________DAI評(píng)分____________________________1 d 4 d 7 d 10 d 14 d正常對(duì)照組 2.00±0.82 1.80±0.79 1.30±1.06 1.70±0.48 1.40±0.84模型對(duì)照組 8.10±1.49?? 6.90±2.07?? 4.50±2.07?? 4.10±1.66?? 4.80±1.23??SASP組 8.50±1.81?? 6.90±1.20?? 2.90 ±1.37?△ 2.80±1.40?△ 1.90 ±0.74△△康復(fù)新液低劑量組 7.50±1.12?? 7.00±1.67?? 4.20±1.37??▲ 3.90±2.21?? 2.70±0.82??△△▲康復(fù)新液中劑量組 8.20±1.93?? 6.70±2.78?? 3.90±1.91?? 3.30±1.83? 2.40±0.84??△△_康復(fù)新液高劑量組 8.30±1.76?? 6.20±1.89?? 3.00±1.83? 2.60±1.71△ 2.00±0.79△△

2.2 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠臟器指數(shù)的影響 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,該模型及藥物對(duì)大鼠肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)均無影響。

2.3 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸的影響 模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸指數(shù)顯著增大、長(zhǎng)度顯著縮短及長(zhǎng)寬比顯著減小,各給藥治療組大鼠結(jié)腸指數(shù)顯著減小,SASP組結(jié)腸長(zhǎng)度、長(zhǎng)寬比顯著增大。正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜無水腫、糜爛和潰瘍的形成;模型對(duì)照組腸壁可見明顯充血、水腫,沿腸系膜縱向剖開可見近肛段腸壁黏膜有散在的潰瘍點(diǎn)和糜爛;各給藥治療組大鼠腸黏膜病變較模型對(duì)照組有不同程度好轉(zhuǎn)?？祻?fù)新液各劑量組大鼠CMDI顯著降低,結(jié)果見表2。

表2 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸的影響(±s,n=10)

表2 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸的影響(±s,n=10)

__________組別 結(jié)腸指數(shù)/(mg/g) 結(jié)腸長(zhǎng)/(cm) 長(zhǎng)寬比 CDMI評(píng)分正常對(duì)照組 3.77±0.92 19.65±1.09 25.66±3.45 0.60±0.52模型對(duì)照組 7.17±0.87?? 16.37±0.43?? 18.50±3.87?? 3.10±0.88??SASP 組 4.21±0.66△△ 18.39±1.69?△△ 22.64±1.87??△△ 2.00 ±0.47??△△康復(fù)新液低劑量組 5.68±0.55??△△▲▲ 16.73±1.52??▲▲ 19.79±1.59??▲ 2.30±0.67??△△康復(fù)新液中劑量組 4.93±0.75??△△ 17.01±0.65??▲▲ 21.27±1.48??△ 2.20±0.42??△△____康復(fù)新液高劑量組 4.57±0.98?△△ 17.33±0.94??▲ 22.48±1.64??△△ 2.10±0.57??△△

2.4 康復(fù)新液對(duì)大鼠UC血清IL-8、IL-17水平表達(dá)的影響 模型對(duì)照組大鼠血清IL-8、IL-17的表達(dá)顯著增加;給藥治療后,各給藥治療組大鼠血清IL-8、IL-17含量顯著降低,結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 康復(fù)新液對(duì)大鼠UC血清IL-8水平表達(dá)的影響

圖2 康復(fù)新液對(duì)大鼠UC血清IL-7水平表達(dá)的影響

2.5 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織EGF、MPO、TNF-α水平表達(dá)的影響 模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸MPO、TNF-α表達(dá)顯著增加、EGF表達(dá)顯著降低;各給藥治療組大鼠結(jié)腸中TNF-α表達(dá)均顯著減少,柳氮磺胺吡啶腸溶片組及康復(fù)新液高劑量組結(jié)腸中EGF表達(dá)顯著增高、MPO表達(dá)顯著減少;康復(fù)新液高劑量組結(jié)腸中EGF、MPO、TNF-α表達(dá)水平與SASP組相當(dāng),結(jié)果見圖3、圖4、圖5。

圖4 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織MPO水平表達(dá)的影響

圖5 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織TNF-α水平表達(dá)的影響

2.6 康復(fù)新液對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織HS分值的影響 正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整,黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層完整清晰,腸黏膜上皮完整,腺體排列整齊,隱窩正常,細(xì)胞形態(tài)正常,整體無充血水腫現(xiàn)象,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型對(duì)照組大鼠上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞及HS評(píng)分顯著升高;各給藥治療組大鼠上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞和HS評(píng)分均顯著降低,其中康復(fù)新液高劑量組與SASP組評(píng)分?jǐn)?shù)值相當(dāng),無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果見圖6、圖7、圖8及中插彩版圖9。

圖6 康復(fù)新液對(duì)大鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞的影響

圖7 康復(fù)新液對(duì)大鼠結(jié)腸組織炎細(xì)胞的影響

圖8 康復(fù)新液對(duì)大鼠結(jié)腸組織HS總分值的影響

圖9 UC大鼠結(jié)腸組織病理切片 (H.E.染色,×200)

3 討論

本試驗(yàn)采取家兔結(jié)腸抗原致敏聯(lián)合醋酸誘導(dǎo)大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎,UC大鼠結(jié)腸病變特征與人類潰瘍性結(jié)腸炎的病變較為相似[16]。完全弗氏佐劑可以加強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的反應(yīng)并刺激局部免疫反應(yīng),多次多點(diǎn)注射后,引起大鼠免疫過度或者無節(jié)制免疫反應(yīng)[17]。乙酸破壞腸黏膜,增加血管通透性,激活激肽,干擾凝血,啟動(dòng)炎癥[18],形成局部炎癥病變,最后給予抗原灌腸,引發(fā)大鼠全身性的免疫反應(yīng),達(dá)到全身免疫變化異常和局部炎癥病變的結(jié)合,最終誘導(dǎo)成慢性潰瘍性結(jié)腸炎。

造模后大鼠出現(xiàn)典型UC癥狀,經(jīng)康復(fù)新液灌腸治療后,與模型對(duì)照組相比較,UC大鼠體征及各項(xiàng)炎癥指標(biāo)均不同程度的改善。炎性趨化性因子IL-8,能趨化嗜中性粒細(xì)胞作用于炎癥部位,MPO含量的變化可反映嗜中性粒細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)程度,康復(fù)新液灌腸后 UC大鼠IL-8和MPO的表達(dá)均顯著降低,證實(shí)康復(fù)新液灌腸能有效減輕UC的炎癥;Th17細(xì)胞是一類產(chǎn)生IL-17的Th細(xì)胞亞群,與許多炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),IL-17通過促進(jìn)釋放TNF-α前炎性細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng),而TNF-α又是公認(rèn)的介導(dǎo)UC的細(xì)胞因子參與了UC的發(fā)生、發(fā)展[19-21],上述試驗(yàn)中模型對(duì)照組大鼠IL-17和TNF-α表達(dá)顯著增加,經(jīng)康復(fù)新液灌腸后UC大鼠 IL-17和TNF-α的表達(dá)顯著減少,推測(cè)康復(fù)新液通過參與免疫調(diào)節(jié)起到緩解UC的癥狀;EGF能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化,在UC大鼠腸道黏膜損傷和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[22],康復(fù)新液灌腸給藥后,UC大鼠CMDI分值降低、結(jié)腸EGF的表達(dá)顯著增加、HS評(píng)分上皮細(xì)胞分值顯著下降,證實(shí)康復(fù)新液促進(jìn)腸損傷黏膜修復(fù),起到緩解UC癥狀的作用。