高 倞

(河南省新蔡縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 新蔡 463500)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)可以引起豬、山羊、水貂、貉、牛、梅花鹿等多種動物及人發(fā)病,可以引起多種動物及人的敗血癥、腦膜炎、肺炎、支氣管炎、泌尿系統(tǒng)及創(chuàng)傷感染等[1-2]。肺炎克雷伯氏菌是一種廣泛分布于自然界中的人獸共共患的條件性致病菌,主要存在多種動物及人的呼吸道、消化道等,當外界條件改變時,機體抵抗力下降,可以引起該病的發(fā)生,發(fā)病率和死亡率均較高,成為威脅養(yǎng)殖業(yè)主要的細菌性傳染病之一[3]。相關(guān)研究表明了肺炎克雷伯氏菌病出現(xiàn)嚴重耐藥性,且多為多重耐藥,并且對β-內(nèi)酰胺類及碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生了廣泛的耐藥,給該病防治帶來了很大的困難[4]。本試驗從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份中分離得到了43株肺炎克雷伯氏菌,因此,對分離的43株肺炎克雷伯氏菌進行了致病性、血清型、耐藥性等部分生物學特性鑒定。為該地區(qū)豬肺炎克雷伯氏菌病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株來源 從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份,進行肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基、MIAC培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯,均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;ID32E腸桿科細菌鑒定試紙條,購自法國梅里埃生物科技公司;抗菌藥物藥敏紙片,購自上海宸功生物技術(shù)開發(fā)公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA DM-2 000marker、2×TaqMaster Mix,購自寶生物工程(大連)有限公司;常規(guī)的試劑及儀器均由本所微生物與傳染病實驗室提供。

1.3 實驗動物 體重22±2g左右昆明系小鼠220只,購自北京維通利華實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于本實驗室。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng) 從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織,無菌條件下劃線接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h,挑取優(yōu)勢菌接種于MIAC鑒別培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h。挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng),染色鏡檢。

2.2 生化特性鑒定 按照ID32E腸道菌鑒定試條說明書,將純化培養(yǎng)的分離菌株加入ID32E腸道菌鑒定試條中,在37℃培養(yǎng)12 h～24 h,用全自動生化鑒定系統(tǒng)儀進行生化特性鑒定。

2.3 細菌的16S rRNA PCR鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA,以提取的分離菌株的基因組DNA為模板,用細菌的16S rRNA基因序列通用引物 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′ 對分離菌株進行PCR檢測,用1%瓊脂糖檢測其目的條帶后,將分離菌株的目的基因回收后進行測序,測序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列進行同源性比較與分析。

2.4 細菌致病性試驗檢測 參考文獻[5],對分離菌株人工感染小鼠進行致病性試驗。采用平板計數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為(108CFU/mL),每株分離菌腹腔注射5只小鼠,劑量為0.3 mL(108CFU/mL),對照組腹腔注射等量的營養(yǎng)肉湯。在攻毒12 h后,觀察其每組的小鼠發(fā)病及死亡情況,對于死亡的小鼠進行細菌分離與鑒定。

2.5 細菌耐藥基因PCR檢測 參考文獻[6],設計6對肺炎克雷伯氏菌莢膜血清型的引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR體系為20 mL： 2 ×TaqMaster Mix 7 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA 2 μL,ddH2O 10 μL。 用梯度 PCR 進行血清型檢測,PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列進行同源性比較與分析。

表1 引物序列

2.6 藥敏試驗 用美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法對分離的致病性病原菌進行藥敏試驗,參照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結(jié)果判斷,分析其耐藥性。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 疑似肺炎克雷伯氏菌分離菌株在7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上長出圓形、扁平、明灰白色的半透明菌落,個別出現(xiàn)溶血現(xiàn)象;在MIAC培養(yǎng)基上為圓形、光滑、桃紅色菌落;染色鏡檢分離菌株為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌。

3.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株均鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性;甲基紅試驗、V-P試驗均呈陽性;不發(fā)酵 D-麥芽糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖;分離菌株用全自動化微生物生化儀鑒定為肺炎克雷伯氏菌,評定結(jié)果合格率為98.9%～99.9%之間。經(jīng)統(tǒng)計采集的74份病料中分離得到43株分離菌為肺炎克雷伯氏菌。

3.3 細菌的PCR鑒定結(jié)果 43株分離菌株均擴增出大約為1 500 bp左右的目的基因條帶,與預期的一致(圖1)。分離菌株的測序結(jié)果后與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列同源性在97.9%～100.0%之間。證實了43株分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。

3.4 細菌致病性試驗檢測結(jié)果 攻毒組的小鼠在攻毒后的2～6 d,出現(xiàn)不同程度的發(fā)病與死亡,從死亡的小鼠體內(nèi)分離到了肺炎克雷伯氏菌,對照組小鼠無明顯的癥狀及死亡。致病性試驗結(jié)果表明,30株肺炎克雷伯氏菌分離株對小鼠具有致病性,為致病性肺炎克雷伯氏菌,占分離菌株的69.8%(30/43)。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR結(jié)果

3.5 細菌血清型鑒定結(jié)果 由表2可知,分離的43株肺炎克雷伯氏菌屬于6種血清型,定型的40株,占分離菌株的93.0%,3株檢測出血清型。其中K20和K5為該地區(qū)肺炎克雷伯氏菌流行的主要血清型,分別占分離菌株的37.2%、27.9%。40株肺炎克雷伯氏菌血清型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與與Gen-Bank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的血清型的基因序列同源性在98.9%～99.9%之間。

表2 分離菌株血清型鑒定結(jié)果

3.6 細菌耐藥性分析結(jié)果 藥敏試驗由見表3可知,分離菌株對43株肺炎克雷伯氏菌分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、阿米卡星、氟苯尼考7種藥物耐藥率較高,耐藥率在51.2% ～100%之間;對頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素4種藥物的耐藥率在18.6%～234.9%之間。

表3 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

由見表4可知,43株肺炎克雷伯氏菌分離菌株呈現(xiàn)多種耐藥性,耐12種藥物的有3株、耐11種藥物有5株、耐10種藥物有11株、耐12種藥物有12株、耐8種藥物有6株,耐7種藥物有4株,耐6種藥物有2株,其中耐10、9種藥物分離菌株最多,分別占分離菌株的25.6%、27.9%。

表4 多重耐藥性結(jié)果

4 討論

肺炎克雷伯氏菌屬中主要包括3個亞種,分別為肺炎克雷伯氏肺炎亞種、臭鼻亞種及鼻硬結(jié)亞種,3個亞種中肺炎克雷伯氏肺炎亞種分布最為廣泛,是引發(fā)多種動物發(fā)病的主要的病原菌之一[2-5]。相關(guān)研究表明了在臨床中的感染僅次于大腸桿菌和綠膿桿菌,呈世界性分布,該菌當外界環(huán)境改變時,該菌可以導致動物體抵抗力下降,引起動物感染發(fā)病,嚴重者可以造成敗血癥,個別的呈現(xiàn)急性死亡。本試驗從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份中分離得到了43株肺炎克雷伯氏菌,對分離的43株肺炎克雷伯氏菌進行了致病性、血清型、耐藥性等部分生物學特性鑒定。通過人工感染小鼠致病性結(jié)果顯示,分離的43株肺炎克雷伯氏菌中30株為致病性肺炎克雷伯氏菌,占分離菌株69.8%(30/43)。說明了該地區(qū)豬肺炎克雷伯氏菌感染嚴重且有一定致病性,且在該地區(qū)廣泛流行,在豬的養(yǎng)殖過程中應引起重視。

本試驗研究表明了分離的43株肺炎克雷伯氏菌屬于6種血清型,定型的40株,占分離菌株的93.0%,3株檢測出血清型。其中K20和K5為該地區(qū)肺炎克雷伯氏菌流行的主要血清型。與王建莉[6]報道存在一定差異性,可能與感染宿主不同或者與該菌流行的地域有關(guān),國內(nèi)關(guān)于豬源肺炎克雷伯氏菌血清型調(diào)查未見報道。

相關(guān)研究表明,肺炎克雷伯氏菌對藥物耐藥性的產(chǎn)生與擴散,多重耐藥菌株出現(xiàn)的越來越多,降低了治療效果[7]。本試驗研究表明,43株分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素等7種藥物耐藥性較高,耐藥率在51.2%以上,對其他藥物的耐藥率在18.6% ～234.9%之間,且呈現(xiàn)多重耐藥性,耐10、9種藥物分離菌株最多,分別占分離菌株的25.6%、27.9%。從而證實了該菌豬源肺炎克雷伯氏菌對常用抗菌藥物產(chǎn)生很強的耐藥性,呈現(xiàn)了多重耐藥性。因此,在養(yǎng)殖過程中應該引起重視。馮娜等[5]、王羽等[5]、韓坤等[8]、劉海林[9]等報道的與本試驗研究存在一定的差異性,可能與感染的宿主或者地域有關(guān)。本試驗為該地區(qū)豬源肺炎克雷伯氏桿菌的防治提供理論基礎。