白燕雨,劉家祺,熊云梅,段晉偉,郭 耀,喬婷婷,唐 芳,霍乃蕊,古少鵬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)對人和牛等多種動物均具有易感性,致病性強(qiáng),分布廣泛,對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)[1],并可形成微生物氣溶膠廣泛散布于養(yǎng)殖場內(nèi)外環(huán)境空氣中[2],是奶牛養(yǎng)殖過程中的主要致病菌之一。養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的廣泛分布與散播,不僅影響圈舍內(nèi)動物的健康,同時也給養(yǎng)殖場工作人員和周邊居民帶來威脅,引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[3]。隨著抗生素被廣泛用于治療由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病,導(dǎo)致耐藥菌株和多重耐藥菌株的出現(xiàn)[4],加劇了該病的防治難度。

研究表明,豬場中S.aureus可通過微生物氣溶膠傳播[5],雞糞中的S.aureus可通過微生物氣溶膠散播于雞場環(huán)境和場外下風(fēng)向中[6];段會勇[7]等的檢測顯示,兔舍中的S.aureus可長時間停留在舍內(nèi)空氣中,借助氣流等外界因素傳播到舍外一定距離,并可通過呼吸道進(jìn)入人畜體內(nèi)引起發(fā)病。

本試驗(yàn)從奶牛場內(nèi)、外環(huán)境以及牛場糞土中分離、鑒定S.aureus,通過耐藥性監(jiān)測和ERIC-PCR技術(shù),分析牛場內(nèi)、外環(huán)境中金黃色葡萄球菌耐藥情況和氣載S.aureus的散播特點(diǎn),以期為牛場環(huán)境控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 奶牛場基本概況 奶牛場周圍為農(nóng)田,場內(nèi)建有圈舍、擠奶間、運(yùn)動場、飼料間、員工休息區(qū);圈舍為半開放式雙排結(jié)構(gòu),飼養(yǎng)密度為50頭/棟;圈舍內(nèi)自然通風(fēng),建有糞尿收集坑道;每日06：00～08：00、18：00～20：00擠奶兩次,全天自由采食飲水;圈舍每日定時打掃和投放飼料。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 糞土(Dungsoil)樣本：采集奶牛運(yùn)動場中多處混合糞土,以1∶9的比例用無菌生理鹽水稀釋,搖床中充分震蕩混勻,吸取100 μL均勻涂布于5%綿羊血瓊脂平板,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。

牛場內(nèi)、外環(huán)境空氣樣本：使用Andersen-6級標(biāo)準(zhǔn)空氣微生物采樣器采集空氣樣本,采集基質(zhì)為5%綿羊血瓊脂平板,分別于牛舍內(nèi)(Inform)、牛場外上風(fēng)向10 m處(Upwind 10 m)、下風(fēng)向10 m、50 m、100 m處各選取3個采樣點(diǎn),每次3 min,每點(diǎn)3個重復(fù)。

1.3.2S.aureus的分離純化 挑取血平板上符合S.aureus生長特性的疑似菌落,革蘭染色鏡檢,將革蘭陽性球菌,接種到BP培養(yǎng)基進(jìn)行選擇純化培養(yǎng),選取BP培養(yǎng)基上黑色周圍有灰白色圈的菌落在營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)[8]。

1.3.3 DNA的提取和PCR鑒定 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌落DNA,利用16S rRNA分析技術(shù)[9]對S.aureus進(jìn)行分子鑒定。金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陽性對照菌株,白色葡萄球菌(26101-19)作為陰性對照。

參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計引物,引物序列為：P1：5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′ P2： 5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′

擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2 ×EasyTaqPCR Super-Mix 12.5 μL,去離子水 10 μL,DNA 模板 1.5 μL(100 ng/μL),上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min,94℃變性30 s,57.5℃退火40 s,72℃延伸40 s,共35個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃ 保存[10]。取10 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)拍照后分析結(jié)果。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 選擇12種臨床常用抗生素對分離鑒定的S.aureus菌株采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),試驗(yàn)操作及判定參照美國CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 ERIC-PCR指紋圖譜分析 參考文[11]獻(xiàn)設(shè)計 ERIC-PCR 引物,引物序列為：ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′

擴(kuò)增反應(yīng)體系同1.3.3。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min,90℃變性30 s,52.5℃退火60 s,72℃延伸60 s,共32個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存[11]。取10 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)拍照。對ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行處理,標(biāo)記產(chǎn)物條帶并生成矩陣圖,構(gòu)建遺傳關(guān)系進(jìn)化樹圖。將每個菌株對應(yīng)的圖譜作為一個分類學(xué)單位,認(rèn)為遺傳相似系數(shù)≥90%的菌株來源相同[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1S.aureus的分離鑒定結(jié)果 經(jīng)分離純化培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢粗篩出株疑S.aureus71株。通過16S rRNA保守序列分析技術(shù)對疑似菌進(jìn)行PCR分子鑒定,擴(kuò)增的目的片段為450 bp左右,檢測出51株陽性菌株含有與標(biāo)準(zhǔn)S.aureus標(biāo)準(zhǔn)株相同的目的片段,確定為S.aureus,其中在糞便樣本中檢出16株,牛舍空氣樣本中檢出21株,牛場外下風(fēng)向10 m、50 m和100 m處分別檢出6株、4株和4株,在牛場上風(fēng)向空氣樣本中未檢測出S.aureus。見圖1。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 所有分離的S.aureus對P-G的耐藥情況最為嚴(yán)重,耐藥率為100%,其次是SXT、STR、TOB、RIF、TET,耐藥率分別為 64.7%、45.1%、33.3%、29.4%、23.5%。其中糞土、牛場內(nèi)、場外下風(fēng)空氣中S.aureus對SXT的耐藥率分別為100%、57.14%、35.71%,對STR的耐藥率分別為56.2%、42.9%、35.7%,對TOB的耐藥率分別為37.5%、33.3%、28.57%,對RIF的耐藥率分別為43.75%、28.57%、14.28%,對TET的耐藥率分別為37.5%、19.05%、14.29%,對CFP的耐藥率分別為25%、9.52%、7.1%,對GEN的耐藥率分別為18.75%、9.52%、14.28%,對NOR的耐藥率分別為31.25%、9.52%、7.14%,對 ERY的耐藥率分別為 0、0、14.28%,對Ni的耐藥率分別為6.25%、0、42.85%,見表1。

圖1 S.aureus PCR鑒定結(jié)果

表1 S.aureus藥敏結(jié)果

對51株S.aureus的多重耐藥分析發(fā)現(xiàn)：檢測菌株的多重耐藥率為76.5%(39/51),多重耐藥種數(shù)主要集中在2耐～7耐之間,有2株菌對8種以上抗生素耐藥,見圖2。

圖2 S.aureus多重耐藥結(jié)果

2.3S.aureus的ERIC-PCR指紋圖譜分析 ERICPCR擴(kuò)增得到S.aureusDNA指紋圖譜,應(yīng)用NTSYS-pc2.10分析軟件構(gòu)建遺傳關(guān)系進(jìn)化圖,得到各菌株之間的遺傳相似系數(shù)。被測菌株在遺傳相似度上整體被分為兩大分支,其中牛舍空氣和運(yùn)動場糞土中分離的21株S.aureus中有19株菌遺傳相似系數(shù)≥90%;牛場外下風(fēng)向與牛場糞土和牛舍空氣中有7株菌遺傳相似系數(shù)≥90%,見圖3。

圖3 采樣點(diǎn)分離株聚類分析圖

3 討論

3.1 牛場環(huán)境中S.aureus的危害S.aureus是重要的環(huán)境致病菌,是引起牛急性、慢性乳房炎的主要病原,并可通過空氣侵染人和動物呼吸系統(tǒng)引起氣管炎、肺炎,化膿性炎癥[1]。本研究在同一時間段從牛舍空氣、牛場糞土和牛場外環(huán)境樣本中分離出71株疑似S.aureus,經(jīng)16S rRNA保守序列分析技術(shù)鑒定出51株S.aureus,檢出率分別為70%(21/30)、88.9%(16/18)、58.3%(14/24)。 根據(jù) Andersen-6級空氣收集器的采樣特點(diǎn),后期我們分析發(fā)現(xiàn),分離得到的S.aureus大約70%可進(jìn)入人和牛體肺泡,對牛和養(yǎng)殖人員造成很大的潛在威脅。其中牛場糞土中的S.aureus分離率明顯高于牛舍和牛場外空氣,所以在實(shí)際養(yǎng)殖過程中要及時清除牛舍和運(yùn)動場的糞便,重視牛舍環(huán)境空氣消毒。上風(fēng)向采樣點(diǎn)中未分離出S.aureus,這可能與上風(fēng)向S.aureus濃度較低有關(guān),而且風(fēng)向、溫度等外界環(huán)境因子也會影響S.aureus的存活力[3],這與鐘召兵[6]等人在雞場的上風(fēng)向10 m、50 m處均未檢出S.aureus的結(jié)果一致;在牛場下風(fēng)向50 m、100 m處均檢出S.aureus,提示S.aureus可隨氣流在一定范圍內(nèi)散播[2],所以在牛養(yǎng)殖場選址上應(yīng)該盡量遠(yuǎn)離居民區(qū)、生活水源等。在奶牛場糞土和牛舍空氣中都檢測到大量的S.aureus,這不能排除牛場其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)中存在S.aureus的可能性,在奶牛養(yǎng)殖過程中,這部分S.aureus可通過破損的表皮黏膜、毛囊、消化系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)侵入動物機(jī)體,引起局部化膿感染,甚至敗血癥,還可污染奶源,經(jīng)食物鏈引起人的食源性感染[1]。

3.2S.aureus的耐藥性 該牛場環(huán)境中的S.aureus多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,對P-G均耐藥,對SXT、STR、TOB、RIF、TET有不同程度的耐藥,流行病學(xué)調(diào)查顯示,S.aureus耐藥譜與牛場臨床用藥基本相符,故在臨床治療中應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取抗生素。糞土、牛舍、牛場外下風(fēng)空氣中S.aureus對ERY的耐藥率分別為0、0、14.28%,牛舍內(nèi)未檢出對ERY耐藥的S.aureus,但在場外下風(fēng)向中檢出2株對ERY耐藥的S.aureus,提示該菌株可能來源于養(yǎng)殖場周圍環(huán)境;場外下風(fēng)向中耐NiS.aureus的檢出率明顯高于糞土和場內(nèi)空氣中,說明部分S.aureus可能來源于養(yǎng)殖場周圍環(huán)境。牛場下風(fēng)向與牛場糞土和牛舍空氣分離的S.aureus耐藥譜有一定程度的一致性,提示這部分S.aureus是通過牛場微生物氣溶膠隨空氣向周邊環(huán)境散播的。

3.3S.aureus親緣性分析 對S.aureus遺傳相似系數(shù)比較分析發(fā)現(xiàn),牛舍空氣中90.5%(19/21)、牛場外空氣中50%(7/14)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數(shù)≥90%,表明奶牛養(yǎng)殖場內(nèi)、外環(huán)境空氣中的S.aureus主要來源于糞土,該結(jié)論也在S.aureus耐藥性中得到。糞土中的S.aureus可經(jīng)過一定的理化過程進(jìn)入空氣,形成微生物氣溶膠散布于牛舍中,并借助氣流等外力的影響散播到養(yǎng)殖場下風(fēng)向空氣中。牛舍空氣中有9.5%(2/21)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數(shù)≤85%,提示這部分的菌株可能來源于牛體或帶菌的養(yǎng)殖人員;牛場外空氣中50%(7/14)的S.aureus與糞土中的S.aureus遺傳相似系數(shù)≤85%,提示養(yǎng)殖場外環(huán)境空氣體中的S.aureus部分來源于牛場,也有部分來源于周邊外環(huán)境。